分离单核细胞时，如何吸取白膜层？

lxy07

如题，请问Ficoll分离全血单核细胞时，首先，如何才能准确吸取到白膜层，其次，我们用的是国产分离液，离心后试管内没有形成明显的白膜层，白膜层和分离液层界限不明显，这种情况应该如何改善？

wanglinling

是用50ml离心管梯度的吗？白膜层应该是比较明显的，可以用1ml枪头触及分离液与上层交接处的白膜层直接吸，一般7ml左右可以完全吸干净。如果没有明显的白膜层考虑1，单核细胞数量偏少。2，梯度的时候操作不当导致分界层模糊。3，降速太快扰乱了本来界限清楚的白膜层。

wanglinling

如果是上面的某种原因导致的可以改善的方法：1，梯度液应在室温18-25°使用。2，铺梯度的时候尽量放液慢，可以倾斜离心管。3，离心结束的降速调低。

cloudycity

1.首先确定你的血样和ficoll是同一种属的吧。不同种属血样的密度不同，ficoll的密度也不同，分离效果也不一样的。% Y+ j4 a* ?4 f# T4 Z
2.国产的，应该也可以，以前我都使用tbd的，效果比一些进口的还好···如果不行就换其他牌子，还有，离心的时候，一定要无阻力降速，就是把降速调低，以免降速的时候，又把血荡混了。
- L" {' a# B5 m4 h! }" h. M; X# E6 v5 {) U3.你的血样来源？你的血样有多少？血样是否新鲜？是不是太稀了？不新鲜的血，有凝块也分不好，比较好的就是血加上去后，自然沉降时红细胞是像细雪一样的均匀，很漂亮的，而不要有凝块。基本上全血1：1用pbs稀释，然后50mL离心管内含15ml ficoll 再加30ml稀释过的血液，1800rpm 20min升降速都调低，应该都会很明显的。外周血会好分一点，脐血的话可以用羟乙基淀粉先沉降红细胞1-2h，然后取上清再分。1 d% o6 E! h$ l- c( M: J7 J4 F% O
4.如果实在不行，你就估摸着，50ml离心管，白膜大概就在15ml刻度的位置，你把上下2.5ml刻度的液体都吸了。

lxy07

回复 wanglinling 的帖子2 m6 g0 i4 V5 Z- e9 O0 N4 d; @

! k' r; F% Q9 Y1 x- \是50ml离心管，降速已经调低了。

wanglinling

回复 lxy07 的帖子
+ z9 @2 x9 `/ M: ?2 W7 ?; h' X/ v. `# G% E0 ^" [( h
那你应该观察一下刚铺好梯度的时候分层是否明显，可以看出你铺的好不好

lxy07

回复 cloudycity 的帖子
: [# f' O+ s0 s: f" G5 G) [
$ C5 E4 M# y+ P- _% b: S1、是人的，Ficoll也是分离人的。
0 p& |8 y4 u% Q. O8 X2、我们用的也是TBD的，降速已经调低了。1 x/ ~; z+ A4 G2 k8 C+ \
3、脐血，75ml，血样算新鲜的，没有凝块。! G: E2 s( `, M6 G& j
4、我看有的帖子上说，取白膜层的时候要蹲着平视离心管操作，这样做是不是能更好的吸到白膜层。

lxy07

回复 wanglinling 的帖子
; e; {  j0 Z' N. ]' P, V* P. y# h4 `
你是说血加上去以后吗？刚铺好不久后，就像cloudycity说的，血自然沉降像细雪一样降下来，但没有看到分层啊。

维维睡啦

1、先检查一下你们的FICOLL是否为MNC专用，其密度是否符合标准,为1.077±0.001。4 s9 @( ?9 P$ ]1 u3 i
2、全血加FICOLL之前要去血浆，稀释的。; V' s# m$ B+ }: l& Z/ g- G9 n! o. C
3、加FICOLL时要小心仔细，使FICOLL和血细胞有明显分层。
0 R' q- K( a5 _' Q4 B) e6 F# `7 J4、FICOLL离心时，升降速都要调低，一般为升6降4就可以。
4 L  D: l# H2 y" d5、离心后即使没有明显白膜层，也会有明显的三个分层，上层为生理盐水和血浆混合，中层FICOLL层，下层血细胞。白膜层就在中层FICOLL层中，即使没有明显分层，绝大多数单个核细胞也是在这一层中，如果没有明显分层，可以把这一层液体全部吸出来，再离心获取单个核细胞。
: b" Y/ G# `8 Q, w; B

lxy07

回复 维维睡啦 的帖子
3 T/ X" m$ ^! o" Q" {6 j" Q
: c3 ?1 ~7 f1 I! d0 k1、Ficoll是MNC专用，密度是1.077。
! ?! x: [0 Y5 J( R8 C0 _! a- X9 Z' H2、去血浆，稀释了。
3 I/ j% ^7 t. ^: r* ]4 O3、FICOLL和血细胞有明显分层。
; Z0 F9 b: n2 @$ I4、升降速调低了。% v  C2 u2 q8 }9 X0 R! |7 p
5、离心后有明显的三层，如果将中间层的液体全部吸出来，会使混的红细胞和血小板等杂细胞较多，有的人主张白膜层以下、红细胞层以上的这一层要保持在1公分以上，是否有必要。