培养脐带干细胞没有成功，恳请各位老师指教，谢谢您！！

cloud100

5 @2 O3 c8 }  X- b9 ]我的操作步骤：
, W. A. _! O/ }( Y' `- v; {1.手术室无菌剪取的脐带保存在【4℃含200u/ml青霉素,200ug/ml链霉素的DMEM/F12】中，12h之内带回实验室处理；【以下操作均在冰盒上进行：】% {" ^' _" V  z* J' w9 E
2.超净台内，选取血管内无明显瘀血的脐带小段约2CM长度，剪取后放入【含双抗的PBS溶液中】冲洗4次，将血管内残留血液洗净，直至PBS无明显颜色变化为止；
9 Y0 a/ [; X9 t, W3.小皿内、在DMEM/F12浸泡下对脐带进行分离，待2根动脉分离完毕后，用持针器撕取位于脐带羊膜和静脉之间的胶状组织；
# `3 g/ g% Q) E' r4 a4.用解剖剪将撕取的条索状组织剪碎，呈小颗粒状，大小约1-2立方毫米；: A0 H3 u4 P1 a8 j7 ?7 r' }5 \
5.“NEST”  T25培养瓶用FBS润湿瓶底以后，将小组织块接种到瓶底，约20-25块/瓶；: f* |0 D# n8 J/ f
6.将接种后培养瓶倒置，放到37℃、5% CO2的培养箱中孵育；
$ l2 F3 `9 [4 \+ D9 |7.将倒置的培养瓶分为3批，分别在倒置后18h、20h、22h将瓶子进行翻转（此时组织块周围形成一层膜状液体，有轻微流动性），滴加2.5ml培养液【10% FBS、2mM谷氨酰胺、100u/ml青霉素,100ug/ml链霉素、89% DMEM/F12】，正置、培养箱内继续孵育；6 n( {/ d$ @# ~- m. T- e3 i3 o* ^
8.培养瓶翻转后第6天，培养液呈淡黄色，予以半量换液，添加3ml培养液；
' \3 J2 @7 h8 C9.今天是换液后第4天，（培养后第10天）培养液颜色变化不太明显，呈淡红色，镜下观察无细胞游出，未予换液，打算3天后再行观察换液。$ g4 r. ]8 P! G
) J+ y& L  a( p% F
***另外，我的FBS--- Giboco；DMEM/F12---HyClone；双抗---Sigma； 谷氨酰胺---Amresco;  PBS---Solarbio粉末自己配的。
4 {* y/ @8 k2 J8 T! B$ O* L( v4 V3 `% k) I" Z1 t
我的问题：这次培养的组织块，贴壁很牢，第一次换液几乎没有组织块脱落，由于组织块较小，几乎呈单细胞层进行贴壁，镜下观察细胞间融合也还好，，但是感觉细胞代谢很慢，培养液颜色变化很少，还是淡红色，第10天还是没有细胞游出来。感觉好迷茫......是我的培养方法有问题吗？我养这个细胞已经3个多月了，一直没有成功，真的要哭死了，恳请各位老师指导！！谢谢了！！
! x; F1 w7 R! b6 s, I附图：今天拍的组织块，第一张10倍，第2张15倍3 `$ B* z/ f  w4 ]# b

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jianglei_sd

直接将剪碎的组织块转移到T25瓶子，不用FBS润湿。
, V& c* X% E$ q  N6 A% k& G
. ~* }. J6 @% k- W9 @+ d另外2,3,4步操作要快，不用剪的太碎，不要在冰上太长时间。

单个核细胞

, \/ R& {$ A/ p

0 ?0 C3 q( P* ~& h) V) I  I1 F回复 cloud100 的帖子
* V: N3 E1 D1 ], _4 c. w! W# V6 H/ ~# F/ A
请参照这篇文章的方法试一下：0 K! t7 s2 F+ ^. C
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: o0 I1 Y) _) ^0 i
* z, K9 M! h! H, J9 m) h
另，推荐阅读：8 O" |( W2 ^" k- w1 B
2 i7 t: G7 f6 l4 {! |# d

• 脐带间充质干细胞的贴壁分离方法：& m, j6 H$ D3 m5 W, R" x4 |! M; ]6 T
  http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 请教华通氏胶的剥离：. m  E# l1 z$ Q' U5 l4 X) \
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  ( n7 w: o/ x0 L2 Fhttp://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
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  2 O5 _. p8 A* K  w0 Qhttp://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
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• 脐带间充质贴壁法到底几天换液：
  7 H/ ]- r! z" P2 M1 D- |http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 各位大虾能把自己养的脐带间充质细胞出来晒晒吗?
  5 b/ Z/ c! d0 U4 W- C# rhttp://www.stemcell8.cn/forum-re ... 79-pid-644496.htmll

月_幻影

我与LZ的培养情况有点相似，都是换液的时候很少有组织块掉下来，不过建议LZ再等等，一般我做原代怎么也得两周（14、5天）后才有成片的细胞爬出，还有个人感觉铺瓶的时候不用PBS湿润，直接铺瓶倒置培养4H或过夜后加培养液正置培养即可……祝LZ成功~

月_幻影

我与LZ的培养情况有点相似，都是换液的时候很少有组织块掉下来，不过建议LZ再等等，一般我做原代怎么也得两周（14、5天）后才有成片的细胞爬出，还有个人感觉铺瓶的时候不用PBS湿润，直接铺瓶倒置培养4H或过夜后加培养液正置培养即可……祝LZ成功~

frankhu

看了楼主的实验过程，觉得太过于复杂了，脐带间充质贴壁培养相对来说比较简单，取回的拨完脐带，剪成米粒大小，然后均匀平铺在瓶底，加的培养基要浸润组织但不浮起来为准，培养4小时后补加培养基完全浸没组织，继续培养，然后观察到细胞游离出来，培养基颜色变黄后首次换液。接下来就是隔天换液，待瓶子长满后传代。

cloud100

回复 jianglei_sd 的帖子
% K, x- n7 ?8 z) a- e- l, S' Q5 h! i  P! \! H) o
啊，我之前剪得组织块比较大，可能有个3-4mm长吧，后面全部浮起来了。这次我剪得很碎小，只有1-2mm大小。

cloud100

回复 单个核细胞 的帖子# f* i1 @# f" G+ B  r( Q; I
5 p2 x) M* |. A
好的，谢谢您的指点。。。

cloud100

回复 月_幻影 的帖子
0 ]8 R# T- A3 b1 D. C* S5 K& |9 W- A8 I; _
1 ~! V$ Z, \: b& s, I好的，谢谢您！！我再等等。

cloud100

回复 frankhu 的帖子
+ f9 S/ e: I/ y, X
8 u" A5 k' R, ^  t+ @5 g我之前没有倒置培养，组织块也比这次要大一些，厚一些，但组织块贴壁很松，换液时全掉了，，然后，还想请问您，隔天换液时必须的吗？培养基颜色没有明显变化也要隔天换液吗？