神经干细胞培养死亡原因 求解 神经（附图）

huangzhenbo131

小弟我第一次养神经干细胞，按照文献上的培养方法，需要DMEM/F12培养液，2%B27,EGF和b-FGF，20ng/ml,但是第一养细胞导师就让我只有DMEM/F12基础培养液，细胞开始几天还生长，形成细胞团，大约在7天左右，也就是第一次离心半量换液后，细胞开始大量死亡。培养过程中无污染，导师问起死亡原因，我告诉他说没有生长因子，不能长久生长，结果导师震怒说没有生长因子细胞只是增殖速度慢，也不会死啊。结果小弟被踢出实验室，回去面壁思过。（附注，我导师也没养过神经干细胞），求哪位高手能告知神经干细胞在基础培养液培养条件下死亡可能原因，附上几张照片，高手可以帮我看看那是不是神经球,谢谢大家！

+ c6 I6 l2 m8 p; A大家讨论的很热烈，发表一下我的看法。首先从图片上来看，上面的细胞团应该就是神经球。一般来说当你原代分离出神经细胞培养时，刚开始会有大量非神经干细胞的死亡，同时也会有一部分神经干细胞和神经前体细胞聚集在一起并增殖形成神经球。
1 \% Q/ @' t! Q0 Y2 H4 H" W% k至于你的第二个问题，细胞离心换液后细胞大量死亡。我想直接的原因就是你的培养基的问题，其他的因素都是次要的。你用DMEM/F12基础培养液是肯定养不活神经干细胞的。首先神经干细胞是属于神经谱系的细胞，用DMEM/F12基础培养液来养原代的神经元都养不好，更别说用来养神经干细胞了。你的导师震怒说没有生长因子细胞只是增殖速度慢，也不会死啊，这是不对的。因为MEM/F12基础培养液不能提供神经谱系细胞的基本营养成分。一般养神经干细胞至少要用neural stem cell basal medium,看看它的成分：The Neural Stem Cell Basal Medium contains DMEM/F12 w/o HEPES, w/ L-Glutamine(CHEMICON Catalog No. DF-042-B), 1X B27 CHEM, 2 mM L-Glutamine (CHEMICON Catalog No. TMS-002-C), and 1X Penicilin Streptomycin (CHEMICON Catalog No. TMS-AB2-C).一般B27都是神经谱系细胞的基本营养成分。至于生长因子是不是必须的，看看下面这段话就明白了：
5 M) j. {5 K0 T4 pThe Neural Stem Cell Basal Medium is a defined serum-free, growth factor-free medium that has been optimized for the growth and in vitro differentiation of neural stem cells derived from rodents. When used in conjunction with bFGF or bFGF, EGF and heparin, the basal medium will allow for the proliferation of rat and mouse neural stem cells, respectively. Withdrawal of the growth factors from the Neural Stem Cell Basal Medium will result in the spontaneous differentiation of rodent neural stem cells.3 p3 w2 r0 d9 M3 \9 Z
也就是说加入生长因子后，神经干细胞才能不断更新增殖，也就是说你把它打散传代后它又能重新增殖再形成神经球。不加生长因子，神干不会大量增殖且会自动分化。而你用DMEM/F12基础培养液来养神干就会死亡。

圆圆850

我觉得你可以用DMEM/F12培养基和20%的FBS让其贴壁一到两天换液为neural basal，B27，一般可以维持好长时间，而且神经球之间还会发出好长的神经丝，我原来养过可以维持很多天

huangfei2010

回复 11# huangzhenbo131
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2 X- \: b: I2 p) L* Q
    谢谢回复，知识渊博，对我帮助挺大的。还有一个重要问题，就是神经干细胞机械法和酶消化法那个更好，我用的是机械法，文献上都说机械法效果更好，但导师坚持用酶消化法。还有你能把关于有关神经干细胞必须培养成分标题告诉我，我上Pubmed查查，空口无凭，我无法说服导师啊。万分感谢

huangfei2010

回复 12# 圆圆850
  a$ P0 [' b; V/ S# L, Y. w* `" |% o" V

0 H+ |5 O5 j* f$ L7 f! \    谢谢师姐啊，你说的方法很好呢，只可惜我被踢出实验室了。

dengyuan9

就是干细胞啊，跟我养的一样

huangfei2010

回复 11# huangzhenbo131 2 O3 f( P7 U6 t0 c; @# o( [

4 d3 _4 s7 `& Z. ]0 G8 c' L1 f, `( C7 \7 |& S5 c1 D5 y$ e0 k. H
    咨询版主，昨天我查了一些资料，说从胎鼠脑组织中提取的神经干细胞数量极少，大多是其他种类的干细胞和细胞碎片，用加了EGF/bFGF的选择培养基大约只有1%的细胞存活，存活的大多是神经干细胞，那么就从我离心前的照片来看，细胞大量形成细胞团，不太可能都是神经干细胞球，有没有可能是其他干细胞增殖形成的呢？期待版主回答，谢谢

huangzhenbo131

回复 11# huangzhenbo131 ( m1 P. i$ Q' z" j* u
谢谢回复，知识渊博，对我帮助挺大的。还有一个重要问题，就是神经干细胞机械法和酶消化法那个更好，我用的是机械法，文献上都说机械法效果更好，但导师坚持用酶消化法。还有你能把关于有关神经干细胞必须培养成分标题告诉我，我上Pubmed查查，空口无凭，我无法说服导师啊。万分感谢

% I" g" z3 u# k; b  R/ m# s7 ~8 j: {
不敢说知识渊博，只是多查了查资料。你说的神干传代用机械法好还是酶消化好，两种方法都有各自的好处。酶消化法传代细胞状态比较均匀一致，但对干细胞活性有一定影响。机械法传代细胞状态不是很一致，有成团的有分散的，但对干细胞的活性保持要好一些。各有利弊，看自己的习惯了。
; Z' L2 i8 T5 j: h0 v你说的神经干细胞的必须营养成分标题，这没有什么文献专门讲培养基营养成分的，现在都是商业化的培养基了，就说明它是必须的。当然商业化的培养基成分也是从科研中来的，所以你可以找一些最初神经干细胞培养的文献，看看它的材料与方法部分，应该有这方面的信息。这里提供两篇比较早的关于神干文献的标题里面应该有相关信息，不过我没看全文。
: g, a  w; j+ s+ A& e; t5 b1. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.
+ o9 T, t' P3 q, b& D) `Reynolds BA, Weiss S.5 Z6 i; l( }. R; q! k
Department of Pathology, University of Calgary Faculty of Medicine, Alberta, Canada.4 \& I1 g& ^. \& A% x7 ]) ]
Science. 1992 Mar 27;255(5052):1707-10
% Z# d5 p5 |' e1 j, z2. Clonal and Population Analyses Demonstrate That an EGF-Responsive Mammalian Embryonic CNS Precursor Is a Stem Cell # g+ z' X/ b+ B# ?8 `8 A. Q
Brent A. Reynolds and Samuel Weiss9 Z4 @6 X+ P/ n% {" D( m
Developmental Biology
1 T" a3 G/ T0 u+ zVolume 175, Issue 1, 10 April 1996, Pages 1-13

huangzhenbo131

回复 11# huangzhenbo131 ' Z" e6 U2 ?$ e/ Y
咨询版主，昨天我查了一些资料，说从胎鼠脑组织中提取的神经干细胞数量极少，大多是其他种类的干细胞和细胞碎片，用加了EGF/bFGF的选择培养基大约只有1%的细胞存活，存活的大多是神经干细胞，那么就从我离心前的照片来看，细胞大量形成细胞团，不太可能都是神经干细胞球，有没有可能是其他干细胞增殖形成的呢？期待版主回答，谢谢

. z  X$ N1 C1 X' r% i呵呵，这个问题一直都存在争议的。现在对神经干细胞还没有一个非常好的鉴定标准。神经干细胞，神经祖细胞，神经前体细胞的界定还不是十分明确。你说刚分离出来的细胞形成细胞球，不大可能都是神经干细胞球，那是肯定的，更准确的说应该是神经球里的细胞不可能都是神经干细胞。你要知道分离出来的原代细胞脱离了体内的生存环境，在体外很难存活，所以一些有增殖能力的细胞倾向于聚集在一起，创造一个微环境有利于其存活。所以刚开始形成的神经球里有多种细胞：前体细胞、祖细胞、未成熟的神经元细胞等有增殖能力的细胞都有可能。实际上神经球的分析方法中有单克隆分析，就是让神经球分散成单细胞，然后让某个单细胞再克隆形成神经球。但神经球本身是存在一定异质性的。关于神经球分析方法的缺陷已经有很多文章论述过了，但由于这种方法相对来说方便和稳定，所以大家都还在采用，再者暂时还没有好的办法。这里有两篇nature methods两篇关于神经球方法的论述文章，大家有兴趣可以看看。

ziyunfei1982

没听说过不加生长因子的。不加生长因子细胞不能长时间存活。别省钱，玩神经干就是玩钱

ziyunfei1982

加血清后就分化，血清和生长因子不能同时加，否则细胞大量死亡