培养脐带干细胞没有成功，恳请各位老师指教，谢谢您！！

cloud100

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我的操作步骤：
' D! Q7 o2 G! j. ^. z' P# g1.手术室无菌剪取的脐带保存在【4℃含200u/ml青霉素,200ug/ml链霉素的DMEM/F12】中，12h之内带回实验室处理；【以下操作均在冰盒上进行：】
9 Y/ ~5 v+ x: _3 f; a# X4 `* D2.超净台内，选取血管内无明显瘀血的脐带小段约2CM长度，剪取后放入【含双抗的PBS溶液中】冲洗4次，将血管内残留血液洗净，直至PBS无明显颜色变化为止；
9 z& q. c  z* X5 {3.小皿内、在DMEM/F12浸泡下对脐带进行分离，待2根动脉分离完毕后，用持针器撕取位于脐带羊膜和静脉之间的胶状组织；& M# |! n6 @3 E* {" _' a% C
4.用解剖剪将撕取的条索状组织剪碎，呈小颗粒状，大小约1-2立方毫米；
% X4 f( K% L- B3 Z5.“NEST”  T25培养瓶用FBS润湿瓶底以后，将小组织块接种到瓶底，约20-25块/瓶；" n9 F  C  ^0 f/ E' L5 P
6.将接种后培养瓶倒置，放到37℃、5% CO2的培养箱中孵育；
5 l6 V: z  w8 |6 D7.将倒置的培养瓶分为3批，分别在倒置后18h、20h、22h将瓶子进行翻转（此时组织块周围形成一层膜状液体，有轻微流动性），滴加2.5ml培养液【10% FBS、2mM谷氨酰胺、100u/ml青霉素,100ug/ml链霉素、89% DMEM/F12】，正置、培养箱内继续孵育；; e' @. ]! O, v4 p0 j) L  h
8.培养瓶翻转后第6天，培养液呈淡黄色，予以半量换液，添加3ml培养液；
0 q' i* K5 R8 N! A9.今天是换液后第4天，（培养后第10天）培养液颜色变化不太明显，呈淡红色，镜下观察无细胞游出，未予换液，打算3天后再行观察换液。
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***另外，我的FBS--- Giboco；DMEM/F12---HyClone；双抗---Sigma； 谷氨酰胺---Amresco;  PBS---Solarbio粉末自己配的。" @" C  ~3 F) n; [' P
8 X- N3 e3 T6 N5 }! }1 S
我的问题：这次培养的组织块，贴壁很牢，第一次换液几乎没有组织块脱落，由于组织块较小，几乎呈单细胞层进行贴壁，镜下观察细胞间融合也还好，，但是感觉细胞代谢很慢，培养液颜色变化很少，还是淡红色，第10天还是没有细胞游出来。感觉好迷茫......是我的培养方法有问题吗？我养这个细胞已经3个多月了，一直没有成功，真的要哭死了，恳请各位老师指导！！谢谢了！！" M" V7 O* I  ]$ h1 X. F
附图：今天拍的组织块，第一张10倍，第2张15倍5 a2 f8 a. ?3 p/ U) @0 G

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jianglei_sd

直接将剪碎的组织块转移到T25瓶子，不用FBS润湿。7 g; L8 ]* t% c2 x3 o! j: ]
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另外2,3,4步操作要快，不用剪的太碎，不要在冰上太长时间。

单个核细胞

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4 H6 s! M% ]( L" s" Q9 o回复 cloud100 的帖子
# U. v8 I% T" V+ F, ?  Q& `7 r; E2 D/ h( @# D- _5 r$ Z, d
请参照这篇文章的方法试一下：
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6 R# {9 g/ N  `9 {$ s) l7 e5 V4 d9 r8 z9 L) Z
另，推荐阅读：
5 b5 U# ^2 r9 v" v. j4 d. D$ H& w( c, H' f0 S( f

• 脐带间充质干细胞的贴壁分离方法：
  # v' h* Q" z9 Y: R. b; }6 chttp://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 请教华通氏胶的剥离：
  ( z* _* q5 G: Hhttp://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 应用怎么样的培养技巧可以获得更完美脐带间充质干细胞：5 Y9 \5 U% H' n+ O2 }' [+ e% I8 u" ~
  http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 脐带间充质胶质的备置：' d" O. e8 {1 V0 {/ H( w4 o7 T, r2 {
  http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 脐带间充质细胞贴壁法出芽率怎么这么低：8 d+ Q" p! m( M
  http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 脐带间充质贴壁法到底几天换液：: d6 A" S, Q& N) v8 b( C
  http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 各位大虾能把自己养的脐带间充质细胞出来晒晒吗?7 u7 G) r3 W4 N/ W, P4 x- l; N
  http://www.stemcell8.cn/forum-re ... 79-pid-644496.htmll

月_幻影

我与LZ的培养情况有点相似，都是换液的时候很少有组织块掉下来，不过建议LZ再等等，一般我做原代怎么也得两周（14、5天）后才有成片的细胞爬出，还有个人感觉铺瓶的时候不用PBS湿润，直接铺瓶倒置培养4H或过夜后加培养液正置培养即可……祝LZ成功~

月_幻影

我与LZ的培养情况有点相似，都是换液的时候很少有组织块掉下来，不过建议LZ再等等，一般我做原代怎么也得两周（14、5天）后才有成片的细胞爬出，还有个人感觉铺瓶的时候不用PBS湿润，直接铺瓶倒置培养4H或过夜后加培养液正置培养即可……祝LZ成功~

frankhu

看了楼主的实验过程，觉得太过于复杂了，脐带间充质贴壁培养相对来说比较简单，取回的拨完脐带，剪成米粒大小，然后均匀平铺在瓶底，加的培养基要浸润组织但不浮起来为准，培养4小时后补加培养基完全浸没组织，继续培养，然后观察到细胞游离出来，培养基颜色变黄后首次换液。接下来就是隔天换液，待瓶子长满后传代。

cloud100

回复 jianglei_sd 的帖子9 t' I4 Y% }/ s6 ]
5 X6 M$ q- u( @" ~8 E0 Y! b6 l
啊，我之前剪得组织块比较大，可能有个3-4mm长吧，后面全部浮起来了。这次我剪得很碎小，只有1-2mm大小。

cloud100

回复 单个核细胞 的帖子
) r! P( }* P; |* W
3 V$ @" p/ E6 M. f好的，谢谢您的指点。。。

cloud100

回复 月_幻影 的帖子
( O8 ~# }; t% f5 }8 K+ g- n- V; A% I: w* T1 @# J/ w
好的，谢谢您！！我再等等。

cloud100

回复 frankhu 的帖子- Y6 N& i8 Z$ i& I5 D1 S4 I& J8 ?. D
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我之前没有倒置培养，组织块也比这次要大一些，厚一些，但组织块贴壁很松，换液时全掉了，，然后，还想请问您，隔天换液时必须的吗？培养基颜色没有明显变化也要隔天换液吗？