分离单核细胞时，如何吸取白膜层？

lxy07

如题，请问Ficoll分离全血单核细胞时，首先，如何才能准确吸取到白膜层，其次，我们用的是国产分离液，离心后试管内没有形成明显的白膜层，白膜层和分离液层界限不明显，这种情况应该如何改善？

wanglinling

是用50ml离心管梯度的吗？白膜层应该是比较明显的，可以用1ml枪头触及分离液与上层交接处的白膜层直接吸，一般7ml左右可以完全吸干净。如果没有明显的白膜层考虑1，单核细胞数量偏少。2，梯度的时候操作不当导致分界层模糊。3，降速太快扰乱了本来界限清楚的白膜层。

wanglinling

如果是上面的某种原因导致的可以改善的方法：1，梯度液应在室温18-25°使用。2，铺梯度的时候尽量放液慢，可以倾斜离心管。3，离心结束的降速调低。

cloudycity

1.首先确定你的血样和ficoll是同一种属的吧。不同种属血样的密度不同，ficoll的密度也不同，分离效果也不一样的。
$ E- I( W% k( S  {4 X2.国产的，应该也可以，以前我都使用tbd的，效果比一些进口的还好···如果不行就换其他牌子，还有，离心的时候，一定要无阻力降速，就是把降速调低，以免降速的时候，又把血荡混了。
7 s+ m1 F0 R1 X3 ~3.你的血样来源？你的血样有多少？血样是否新鲜？是不是太稀了？不新鲜的血，有凝块也分不好，比较好的就是血加上去后，自然沉降时红细胞是像细雪一样的均匀，很漂亮的，而不要有凝块。基本上全血1：1用pbs稀释，然后50mL离心管内含15ml ficoll 再加30ml稀释过的血液，1800rpm 20min升降速都调低，应该都会很明显的。外周血会好分一点，脐血的话可以用羟乙基淀粉先沉降红细胞1-2h，然后取上清再分。3 w+ f, r) J5 ?- @- `3 j
4.如果实在不行，你就估摸着，50ml离心管，白膜大概就在15ml刻度的位置，你把上下2.5ml刻度的液体都吸了。

lxy07

回复 wanglinling 的帖子
: m* _; R4 h. Y0 D, [
; U; E0 P& m$ R: C9 o, \是50ml离心管，降速已经调低了。

wanglinling

回复 lxy07 的帖子( N! z: ^( K& S4 c2 ^0 h

. c2 w  ?# [1 B. O) x. v  c* X, x; z那你应该观察一下刚铺好梯度的时候分层是否明显，可以看出你铺的好不好

lxy07

回复 cloudycity 的帖子7 s6 E: X8 {, i, L/ f' z
* V. ^" t: q! U0 M
1、是人的，Ficoll也是分离人的。
, `1 w8 t( z  n' ]9 O2、我们用的也是TBD的，降速已经调低了。
0 k& V' l% l$ Z3、脐血，75ml，血样算新鲜的，没有凝块。
$ Z, t; G& _7 g8 \3 M$ V4、我看有的帖子上说，取白膜层的时候要蹲着平视离心管操作，这样做是不是能更好的吸到白膜层。

lxy07

回复 wanglinling 的帖子" A' J8 M9 F6 K2 X& n
2 H2 a0 A! z/ o+ |* n' i
你是说血加上去以后吗？刚铺好不久后，就像cloudycity说的，血自然沉降像细雪一样降下来，但没有看到分层啊。

维维睡啦

1、先检查一下你们的FICOLL是否为MNC专用，其密度是否符合标准,为1.077±0.001。& d0 I- \1 I6 i( o+ m% S) a
2、全血加FICOLL之前要去血浆，稀释的。
. `/ H) C. y) x3、加FICOLL时要小心仔细，使FICOLL和血细胞有明显分层。  F$ t/ g; b- e7 f3 o) L
4、FICOLL离心时，升降速都要调低，一般为升6降4就可以。
  i; ]" `# s+ C' A: T) l. C5、离心后即使没有明显白膜层，也会有明显的三个分层，上层为生理盐水和血浆混合，中层FICOLL层，下层血细胞。白膜层就在中层FICOLL层中，即使没有明显分层，绝大多数单个核细胞也是在这一层中，如果没有明显分层，可以把这一层液体全部吸出来，再离心获取单个核细胞。
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lxy07

回复 维维睡啦 的帖子2 W% {) G3 ?- P; @% j
2 S: z% q; \7 b+ k
1、Ficoll是MNC专用，密度是1.077。
. y2 _6 z7 w6 Q( B' n9 b9 L3 m& Z* U" P2、去血浆，稀释了。2 m2 F3 ]9 A7 F4 F% G' I
3、FICOLL和血细胞有明显分层。8 T1 @3 y7 d$ T, P
4、升降速调低了。
4 b, I. b) k4 C% a% ^5、离心后有明显的三层，如果将中间层的液体全部吸出来，会使混的红细胞和血小板等杂细胞较多，有的人主张白膜层以下、红细胞层以上的这一层要保持在1公分以上，是否有必要。