分离单核细胞时，如何吸取白膜层？

lxy07

如题，请问Ficoll分离全血单核细胞时，首先，如何才能准确吸取到白膜层，其次，我们用的是国产分离液，离心后试管内没有形成明显的白膜层，白膜层和分离液层界限不明显，这种情况应该如何改善？

wanglinling

是用50ml离心管梯度的吗？白膜层应该是比较明显的，可以用1ml枪头触及分离液与上层交接处的白膜层直接吸，一般7ml左右可以完全吸干净。如果没有明显的白膜层考虑1，单核细胞数量偏少。2，梯度的时候操作不当导致分界层模糊。3，降速太快扰乱了本来界限清楚的白膜层。

wanglinling

如果是上面的某种原因导致的可以改善的方法：1，梯度液应在室温18-25°使用。2，铺梯度的时候尽量放液慢，可以倾斜离心管。3，离心结束的降速调低。

cloudycity

1.首先确定你的血样和ficoll是同一种属的吧。不同种属血样的密度不同，ficoll的密度也不同，分离效果也不一样的。+ q  W. E1 a: g
2.国产的，应该也可以，以前我都使用tbd的，效果比一些进口的还好···如果不行就换其他牌子，还有，离心的时候，一定要无阻力降速，就是把降速调低，以免降速的时候，又把血荡混了。" t+ b2 p/ e3 T" z5 j
3.你的血样来源？你的血样有多少？血样是否新鲜？是不是太稀了？不新鲜的血，有凝块也分不好，比较好的就是血加上去后，自然沉降时红细胞是像细雪一样的均匀，很漂亮的，而不要有凝块。基本上全血1：1用pbs稀释，然后50mL离心管内含15ml ficoll 再加30ml稀释过的血液，1800rpm 20min升降速都调低，应该都会很明显的。外周血会好分一点，脐血的话可以用羟乙基淀粉先沉降红细胞1-2h，然后取上清再分。' S& L% W: _0 i- U' d' y9 b5 A+ w
4.如果实在不行，你就估摸着，50ml离心管，白膜大概就在15ml刻度的位置，你把上下2.5ml刻度的液体都吸了。

lxy07

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是50ml离心管，降速已经调低了。

wanglinling

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: E$ d( C' Y6 H
那你应该观察一下刚铺好梯度的时候分层是否明显，可以看出你铺的好不好

lxy07

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- W- z: `+ s1 {( ~3 N& R! \3 l! O- f5 o* K
1、是人的，Ficoll也是分离人的。, l0 \8 F0 }$ I2 M
2、我们用的也是TBD的，降速已经调低了。
+ ]! b# D7 g& w. Y3 P" F3、脐血，75ml，血样算新鲜的，没有凝块。, @0 [% A% t; n  i/ r
4、我看有的帖子上说，取白膜层的时候要蹲着平视离心管操作，这样做是不是能更好的吸到白膜层。

lxy07

回复 wanglinling 的帖子
0 I% k, p1 U) y  J8 P% _6 G# V5 o5 P' F# O4 Q8 i
你是说血加上去以后吗？刚铺好不久后，就像cloudycity说的，血自然沉降像细雪一样降下来，但没有看到分层啊。

维维睡啦

1、先检查一下你们的FICOLL是否为MNC专用，其密度是否符合标准,为1.077±0.001。
$ V4 U! a9 n4 o, s1 K2 n2、全血加FICOLL之前要去血浆，稀释的。' d: [5 X' @5 u4 ?/ k% G
3、加FICOLL时要小心仔细，使FICOLL和血细胞有明显分层。1 q4 ~& v! U# V; z
4、FICOLL离心时，升降速都要调低，一般为升6降4就可以。. @+ i6 z/ ^# ]
5、离心后即使没有明显白膜层，也会有明显的三个分层，上层为生理盐水和血浆混合，中层FICOLL层，下层血细胞。白膜层就在中层FICOLL层中，即使没有明显分层，绝大多数单个核细胞也是在这一层中，如果没有明显分层，可以把这一层液体全部吸出来，再离心获取单个核细胞。
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lxy07

回复 维维睡啦 的帖子5 d" ?3 t9 Y, h* n+ Z5 B; e
2 j' k$ n7 J. ?  g. \3 F
1、Ficoll是MNC专用，密度是1.077。
! c5 ~8 a$ r' P; G, }2、去血浆，稀释了。
! g. i+ Y0 ~7 P3、FICOLL和血细胞有明显分层。
+ ^% ?1 m/ j: U+ w6 H4、升降速调低了。# V0 p" u0 ?& h6 N8 B4 k" d, f
5、离心后有明显的三层，如果将中间层的液体全部吸出来，会使混的红细胞和血小板等杂细胞较多，有的人主张白膜层以下、红细胞层以上的这一层要保持在1公分以上，是否有必要。