求指导NK细胞培养

yangpan521

哪位大神帮我看看这NK培养流程有没有不妥的地方，细胞数量上不去，着急啊
: Z% x, M+ M% Y1 E1 i% ]" |1 Y, [培养材料：
7 B8 }, h7 l2 A4 u无血清培养基GT -T551、生理盐水、淋巴细胞分离液Ficoll、人血白蛋白、自体血浆
! B& V3 M/ {: R) T2 G4 B1 d$ P7 h3 Y- T细胞因子：IL-2（1000IU/ml）、Anti-Human CD3（5ug/ml）、IL-12(500IU/ml）、IL-15(500IU/ml）  N7 H7 S8 a, s
操作步骤：
4 @( D5 F+ ~8 h5 H* G1、采血机采集外周成分血50ml ，用生理盐水1:1进行稀释，
, E% F- w1 u4 r  F6 C' U- H# B2、由Ficoll液分离，去红细胞，收集初步纯化的单个核细胞：经Ficoll液梯度离心分离单个核细胞，Ficoll液与待分离的单个核细胞悬液比例为3:5分离方法: 取新的50ml离心管，没管加入15mlFicoll分离液，将25ml单核细胞悬液，贴壁轻轻加入管中Ficoll液液面上，注意单个核细胞悬液的加入不能打破离心管中Ficoll液的液面，离心2000rpm/min，20min，升速1，降速0，离心后，液面分为四层，小心吸取第二层的单核细胞层，用无血清GT-T551洗涤2次，离心1800rpm/min，5min，20℃，弃去上清，再用5ml无血清培养液混悬。
9 L2 W8 V$ P1 x: }' |3、细胞计数：吸取约200ul的细胞悬液与1.5mlEP管内，另取一个新的EP管加入90ul台盼蓝和10ul细胞悬液，用血球计数板进计数。
- o$ c. l! f% O8 l. E4、将PBMC密度调整为2X106/ml，转入T75瓶中，培养基加入CD3McAb、IL-2、IL-12、IL-15，并置于培养箱中培养。每隔3d半量换液，并补充相应的细胞因子和自体血浆。
! @5 ]9 A9 Y  e" R7 O3 p$ n$ p2 m8 I5、收集悬浮细胞：培养第10d观察NK细胞并收获NK：将培养瓶内细胞悬液转移至50ml的离心管中，1800rpm,离心5min。去上清，用生理盐水再洗细胞2遍，最后将细胞组分混悬在100ml含1%人血清白蛋白注射用生理盐水中，转入细胞回输袋内，制成NK回输液。! K; G2 C) ?" p& E; a5 ^

pppjjj

大约能扩增多少倍啊？

yangpan521

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1 }$ t2 x0 R. p$ Y8 J
- }) w" K  }+ l) P90倍，有的低，都说可以扩大120倍，也不知哪出问题了

wind789

我看文献上类似方法有滋养细胞共育的。另外楼主你10天时,CD3-CD56+细胞的比例大概是多少呢？双阳的细胞大概是多少呢？

gondobar

楼主如果在成本允许的情况下，可以换更高级的培养基，90倍完全可以达到回输要求……

yangpan521

回复 wind789 的帖子+ _% ?' G) h, {) y# R
3 p8 d0 N6 N2 a* {- z
20%左右

yangpan521

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6 \2 O, }$ Y$ [/ X" f/ Q# ]5 w; w( ~2 K3 `( F- ?
请问我上面的培养不骤没什么问题吧

gondobar

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; r" l8 p0 C7 S$ V) r' t% u. q( {
细胞分离过程和我们不一样，不知道你的方法能得到多少种子细胞。我们大约在5左右（七次方），如果你的方法更多，倒是可以学习一下。

wind789

yangpan521 发表于 2014-8-5 13:24 % ], p, o, t* a  {& \
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9 C9 r& k0 e& F! W3 i; _1 Q8 t5 ^" l  }" P# S
20%左右

5 F3 Y$ W( l5 V# t1 C
这种比例还算是NK吗？

单个核细胞

) i* g* k3 N) Y" L! u1 v
! y' |% f/ Z9 M& b* V4 ?
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Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells
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物料：