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各位老师们好!
' r- [! |. W, q6 \6 r) k 我是一个细胞培养的新手,想请问几个hUC-MSCs培养的问题,谢谢指教!
4 i2 _4 H F2 _0 I! n$ H 我的计划培养步骤是这样的:. y' ~) Y3 L/ { T) K
1.脐带放到运输液(DMEM/F12培养基)中,4°保存,24h之内进行处理;3 X. d: @% R& z5 i
2.超净台中,取出脐带,剪取1CM长的小段,PBS洗净脐带血块,70%乙醇浸泡30s,然后PBS再次洗净乙醇;
' o! x6 u& N2 m' C% k' F3.用解剖剪及解剖镊分离出2根脐带动脉,用解剖镊撕下脐带羊膜和脐带静脉之间的华通胶组织,剪成1-2mm小段;- F7 @. b7 o8 k( p6 Z1 {6 A
4.取T-25 NEST培养瓶,瓶底用FBS湿润,将组织块用巴氏管小心种到瓶底,间隔1cm,每个瓶子大约种下20个组织小块,一次培养3个瓶子的组织块;
" \ k% w @( B7 m8 t" @0 v9 {1 G5.将瓶底朝上,放到37°、5%CO2 的培养箱中,倒置培养过夜(培养12h以上);# f9 c0 R0 }& A
6.过夜后,沿着瓶子侧壁,小心加入完全培养基(10%FBS,90%DMEM/F12,双抗---100u/ml青霉素+100mg/ml链霉素)3ml,瓶底朝下、继续培养箱中培养;
. r5 R* |' `: B) |* E, J/ h7.前三天不要移动培养瓶,第四天开始观察瓶子组织块有没有细胞爬出,培养基是否变黄、需要更换等等。。。' [0 A+ H. o! U( k' X- N
我的问题是:0 R& f( q! T" F- J3 T6 n( u
a:以上步骤有明显错误吗?) {9 }" y4 |" c
b:完全培养基配置时,必须0.22um滤器、过滤除菌吗?
9 X9 T" Q% C7 ^c:文献中大多有添加谷氨酰胺,但我发现自己买的DMEM/F12中本身含有2.5mM的谷氨酰胺,那我配制培养基时还需要另外再添加谷氨酰胺吗?9 h! ?- a( D# b8 N" V3 K7 C
谢谢各位老师的指教!!! |
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