哪位大神会培养造血干细胞

yangpan521

求问哪位大神会培养造血干细胞，可以给我讲解一下，

cantonchn

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  ?1 f# P* \+ ?6 z6 k' x4 R版主楼主，我回了你两个问题，不过我看你问的问题，大都不是这个论坛可以真正公开的，你如果想用这样的方式来解决工作上最基础的问题，我看不妥。得有导师或师傅带着做。

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多多看看文献，查查资料

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培养基为IMDM、30%FBS、100 kU/L青霉素，100 mg/L链霉素rhSCF 50 ng/mL、rhIL-3 20ng/mL、TPO 10ng/mlL、FL 20ng/mL.8 w2 w0 Q$ L1 p- G1 D
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脐带血造血干细胞的分离
2 L) Z$ Q9 ~$ c: v, d(1)        往50 mL离心管里加入15 mL已经恢复至常温的新鲜脐带血，再往脐带血里加入等体积（15 mL）的已经恢复至常温的羟乙基淀粉-550，轻柔混匀，37℃水浴10min。
5 z+ ?4 \3 w8 m$ T  ^(2)        以上体系中加入15 mL的PBS，轻柔混匀，室温自然沉降40min，吸取淡红色混浊的上清液备用，弃去底部红细胞。3 M! `4 u# A* Z3 U( o, F
(3)        向上述步骤中得到的上清液中加入一倍以上体积的PBS，轻柔混匀以500g离心15 min，弃去上清保留细胞沉淀。4 p7 N! [2 P, M; I  U' x
(4)        往细胞沉淀中加入一定量的PBS并重悬细胞，将重悬好的细胞沿管壁缓慢加入事先已经加好等体积Ficoll-Paque PLUS淋巴细胞分离液的15mL离心管中。9 [6 o3 w; ]: D4 a% D3 o4 s! _& i
(5)        400g离心30~40 分钟，转移中间白膜层细胞至另一管，加入3倍以上体积的PBS，混匀，300g离心10分钟，去除上清，再加入8~10mL的MACS Buffer，混匀，吸取50μL用于细胞计数，剩余的细胞300g离心10分钟。
& B  k0 G1 D8 u6 V9 f(6)        弃去上清，MACS Buffer重悬并调整细胞浓度为1×108个/300μL，往每300μL细胞悬液中加入100μL的100μL FcR Blocking Reagent，混匀。再加入100μL 的CD34 MicroBeads，混匀，4℃避光孵育30min。- H3 o9 o; L" V2 m% |
(7)        5~10mL的MACS Buffer洗涤一次，300g离心10min，弃上清。500μL MACS Buffer重悬细胞。
3 U, J/ }7 b0 Q" U(8)        将分选柱置于磁场中，500μL MACS Buffer活化分选柱，勿吹打，MACS Buffer不能有气泡，不要加在壁上，应该直接加在分选柱底部。
& @$ g4 b- U* ~* l(9)        待MACS Buffer自然流干后，往往分选柱上加入细胞悬液，自然流干。0 y# l# }9 ^3 u# b5 q0 v
(10)         500ul的MACS Buffer清洗柱子3次，每次清洗之前要等上次的MACS Buffer自然流干之后加入新的Buffer。4 e: f) a  F# g' X
(11)         将分选柱撤离磁场并架于15mL离心管上，立即用1000μL MACS Buffer将 CD34细胞洗脱下来并收集。如要获得纯度更好的细胞，可将最后一步洗脱下来的细胞置于新的分选柱上重复8~11步骤一次再次富集。初次富集纯度70~85%，再次富集纯度可达95%以上。分离出来的造血干细胞用于纯度的鉴定、集落形成实验和体外培养等。  g! K! i6 S) Q  y) l6 N

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培养基+细胞因子