转录组cDNA文库电泳为何这般？求解

l19rna

3 p# I& p  T0 k3 f. W, P

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2012-8-12 19:36 上传

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+ q  |2 I  ^. H+ Q( a0 l2 {: _
# B. d9 L+ k, N8 t0 C单细胞转录组的cDNA文库1%琼脂糖电泳，弥散条带为何两端这么亮呢？
) k; H6 w+ q- i+ |, z排除浓度太高，胶没做好（做了两天都这样），的理由，) C5 ]" t5 q0 K7 [
难道是因为样品问题嘛？样品经过pcr产物回收（Qiagene）后进行电泳的
* F) R: X, x9 C7 o& S$ g) J6 ~! L" R4 _# K7 G6 v: J9 A5 S
求高手回答

hhs359853381

回复 l19rna 的帖子
! h0 h' v' F6 F# b; J4 Q( o
5 c" X# G4 `* `5 M% Z我也遇到过这个问题，觉得应该是你cDNA的量加的太多了，这个跟浓度没得啥关系吧5 i% l+ K; e( B4 ]2 ?6 T

l19rna

回复 hhs359853381 的帖子0 |0 a( N1 ^) t' u1 c' M
8 e3 C- E5 k% W
不像是cDNA总量太多，我减了上样量也还这样啊，你遇到的情况是怎么解决的啊？  v+ }5 T( h% k0 @: L% d2 l/ e8 _

dahui

请问您这是用什么染色的？EB还是核酸染料，为什么自然光下这么亮，为什么没有用凝胶成像系统拍照？

l19rna

回复 dahui 的帖子
8 k  b! I9 D4 ]8 C; j& G2 ^+ ~3 D, S; {  C. ^0 z! h8 g
染料：syber DNA safe(invitrogen)1 r3 ?$ _3 A% [* U3 w& k
是用成像系统拍的，4 M! S% {1 e3 o9 t) G# x& k. s: E7 P
没带u盘，手机拍了一张电脑屏幕啊，就上传了# r& [" I* s* G/ q2 k

, T) v) c* M5 b. t, j( F+ j您知道这是神马情况么？

dahui

您最好上传成像系统拍照的照片，大家一起帮您分析一下

l19rna

回复 dahui 的帖子$ g9 ]8 }: ^3 P6 w& @, w, x
1 W! G- M" H9 ?2 b  u. I6 I

2012-8-15 15:23 上传

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# [7 o0 z" |& {0 k3 l

' H, L" a  P  m, g其中跑最前面两条带是引物二聚体,通过切胶纯化将其去掉，但是弥散条带
9 G1 }$ ]2 R! h% r% Y. {两端很亮，就让我不知道这个样品里引物还会不会影响我后面的测序
- _9 |$ F1 y/ |+ G
! F9 s5 e' k0 ?9 N+ s
0 ?: q' N+ B) ]9 kmaker 从小到大100bp, 200bp, 300bp......

dahui

首先，用来鉴定PCR结果的转录cDNA结果凝胶浓度可以适当提高，比如说1.2%，因为考虑到mRNA的长短不一以及其半衰期很短，多半降解，RTpcr后很多产物必然片段长度较小，整体呈现SMEAR状，5 [0 k+ |8 }) e+ B! W* M5 F7 {
另外，你的maker选择不合适，很明显没有跑开，这种ladder的marker很明显不适合这种低浓度凝胶，建议更换，并且注意适当延长电泳时间；! r5 S  \+ i! b; w9 `2 X, H3 e
再次，条带下部的成分，我觉得也不是宁说的引物二聚体，因为通常情况下，引物二聚体会跑到最前面，并且是和弥散状条带分开一定距离的，/ G# j8 n" X) b$ k7 j  Z# r! o
然后，强烈建议您鉴定抽提RNA的质量，UV280检测以及电泳检测，并且在进行PCR产物回收时注意乙醇等挥发完全，不要有干扰。' h$ t9 w- F. d( H/ h+ n
条带整体很亮，我没法解释，但是建议您用EB染色试试，并且一定要跑完电泳后再用EB的水溶液染色的方法进行染色。
% r( V  Y) x% _$ L, D. U我所了解的也就这么多了，经验之谈，仅供参考，不负责任何法律责任。7 W: L& G: d* J6 \' m
谢谢。

weiyepan

样品粘度很高的样子，建议稀释5~10倍来跑。

shy8610

楼主的电泳图很亮，两侧发亮的情况的很少见，我觉得如果是用新的无毒染料的话，还是先更换成EB吧,可能效果会不一样，还有楼上几位高人说的，个人也觉得浓度太大，需要稀释，另外Marker没有跑好。