错在哪一步，望赐教！-------谈脐血分离EPC

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具体步骤是：脐血稀释---红细胞裂解液裂解稀释后的脐血---取上清液-----再用密度梯度离心----吸取白膜层（白膜层不是很明显）---PBS洗两便---一部分养在DMEM中想得到MSC，另一部分养在EGM中为了得到EPC（用的是培养瓶，没有铺胶）------可三天后换液（换液时没有发现贴壁的细胞）------换液2天后发现瓶中仍没有贴壁的细胞。结果什么也没培养出来，步骤中哪一步错了，望赐教！

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接种的密度如何，EPC是密度依赖性的，密度低了不长

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另外EPC最好要用FN coat一下

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吸取白膜层（白膜层不是很明显），这一点说明你离心效果不好，注意到离心的细节了吗，我所在实验室他们脐血分离MNC时，离2次心，第一次20分钟，第二次10分钟，白膜层很清楚，而且离心时要采用SLOW SLOW，慢加速，慢减速，况且稀释血液时你的比例是多少，自己摸索过吗？1:1，1:2，还是2:3，3:4？自己不仿按我说的做一遍，看哪种离心效果好，下次把我做的病人的外周血离心后的照片传上来发给你看看，其实还是蛮清楚的。

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另外你是怎么吸取白膜层的?吸取上层血清距白膜层多少时你停止？

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建议2天后半量换液，4天后全量换液，早期RBC比较多，会对EPC有影响，况且EPC48小时内基本都贴壁了，当然换液时一定要小心，尽量少晃动培养皿和培养瓶。

542177563

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呵呵，不好意思，我现在还在摸索中，我最近又做了一次，没有红细胞裂解液，直接把抽来的脐血稀释两倍（脐血：PBS为1:2），然后铺血进行密度梯度离心（Ficoll：脐血为1:2），  在20℃，400g，30min下离心，结果能看到模糊的白膜层，但夹杂着红细胞。吸除上清层（没有注意离白膜层多远），吸取白膜层后加大量的PBS洗涤。结果培养几天还是没有见到贴壁细胞。你能发给我一份你的试验详细步骤吗？我的邮箱542177563@qq.com，万分感谢！

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好的呀，我有空晚上发给你

zz091115

Ficoll的量太少 1:1左右的比例比较合适 其次 离心机要缓升速缓降速 离心时间大约20-30min 15ml的离心管效果比50ml的要好 原因我解释不清楚 可能和液面接触面积有关系 接种密度要大点 板子还是需要铺下纤连蛋白 还有就是 你有没有注意你的Ficoll是人用的还是鼠用的 这两个密度是不一样的

542177563

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谢谢提醒，我原本打算做小鼠骨髓的，所以定的是小鼠的Ficoll液，做了之后发现小鼠骨髓中的EPC很难养，几乎没有任何成功，就转成做人的了，看来我要换一下Ficoll液了！还有EPC是不是一定要铺层？我一般用的是培养瓶，听说瓶底一般有铺层，有时最多用多聚赖氨酸铺一下罢了！这对培养出EPC细胞的影响大吗？