错在哪一步，望赐教！-------谈脐血分离EPC

542177563

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( U  h  {( B- G/ b8 `- J先谢了！

zz091115

回复 542177563 的帖子2 A9 M# m3 B. Q# Z1 s4 y
( O3 J. u; z7 S1 M8 r5 A
纤连蛋白还是别省了 我没做过对比 但是貌似有不小影响 小鼠骨髓效果是不太好 我之前也碰到过 还有和你小鼠有关 老鼠周龄短自然才好做

542177563

回复 穿越地平线 的帖子# i) ]1 ?1 `* U  T$ h) c+ B0 Y

' ]' [" X* c* Q, O2 {7 W看到你培养出的EPC克隆团图片很漂亮，请问是用成人外周血分离+fibronectin涂层培养出来的吗？培养几天得到的？

almasun97184

脐血不能先用红细胞裂解液再密度梯度离心。你做的这一步是为了什么啊？Ficoll的说明书也不是这么写的啊。直接稀释了离心就行。
* q0 L; f+ Y& V. Z3 d脐血稀释倍数和血液Ficoll的比例不是特别重要，有点出入关系不大。1：1到1：2都可以。
1 M, Y& w8 S+ P2 p9 y7 ]离心时的加速度确实非常重要。必须为0。移动的时候也要很注意。- ?7 p1 l3 L3 {6 y0 s
FN还是铺了好，影响不小。没有FN，出来的克隆又少又小。

realinter

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* y# @  S* }3 Q1 d8 n3 _- F8 Y9 e+ r7 S0 U6 Q
同求步骤啊scylc@163.com
' o% a6 D9 l% u3 Q  L9 o另外，EGM-2培养基怎么使用啊，给了很多补充试剂包括EGF,FGF,VEGF ，vc，FBS什么的，是全部加进去吗，还有FBS在 kit里面只有10ml ，要另外补加到10%吗，谢谢

quit6927

542177563 发表于 2012-5-11 21:37
  R- t8 f; j& D* E% x3 G具体步骤是：脐血稀释---红细胞裂解液裂解稀释后的脐血---取上清液-----再用密度梯度离心----吸取白膜层（白 ...

5 r; f3 \, H/ G2 U8 a  ~铺板是必须的。不知道红细胞裂解液处理会不会影响MNC活性，我们直接生理盐水稀释然后就ficoll离心。我们的经验，脐血的分离效率也是很低的，几十ml也就1、2个克隆。

evial

你太有才了，将红细胞裂解法和梯度离心法合二为一！本来外周血EPC就很少啊！洗来洗去的说不定就洗没有了，哈哈

coffee.cat105

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8 Z% s0 A3 @+ O6 b% [& H/ W4 h& B回复 穿越地平线 的帖子
& R8 q0 q. E5 {4 s! K2 m3 G5 k
3 x1 m& V, A3 q2 ?, [能发一份给我不？我们正要开始做，想要一份详细步骤，万分感谢，

PercyLaw

另外，密度梯度离心Ficoll液：血液的比值是在离心管中高度的比，尽量两段都长一点，加血液的时候一定要慢，离心力宜小不宜大，时间长短可以自己摸索一下。而且有的朋友说，Ficoll液的厂家和质量也决定了白膜层的清晰度和分层情况。7 b8 Q0 k! z2 D* j% v, K
我个人感觉还真是不需要红细胞裂解的，直接在ficoll液中加稀释的血液应该就可以。

PercyLaw

个人认为，EPC这种细胞还是比较少而且娇气的，所以洗细胞可以试试用培液（不加血请的，最普通的那种，1640也可以），对细胞的损伤会比较小。