关于慢病毒转染的几个问题咨询

wangwang1987

1. 刚刚在addgene买了几个plasimd. 但是又四个是以Tet-o 开头，有四个是以Ptight 开头.想知道有什么区别么.
( I& j! a' a, v0 ^" D0 x2 x2. 各位有用psPAX2和VSVg 包装的protocol么？因为刚刚开始没什么头绪的感觉，不知道具体用量.. x: a$ |9 h: k% Y+ }5 g

telomerase

我们用的是pMD2G的那个，过程差不多
; K! E1 O0 j4 J4 }和包装逆转录的过程一样，我们用的是lipo，方法请参照lipo用法
' r$ Y  s  z: C9 K, v$ g' I8 n# m( d( k7 y& b. J
要注意的是：
: H2 k( ]* O8 p1 b/ D质粒的比例比较重要
2 N# y3 W  S3 N5 Z. Y7 |4 u细胞的状态比较重要1 N8 `9 P/ c* ?4 q% d' N
包完浓缩下，超离或浓缩柱8 N# P% |/ ?" k
感染时必需要加polybrene，离心效果更佳

wangwang1987

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7 @# G3 _/ P; H! O' E: \2 e
4 h, M8 X+ h& j1 x/ h谢谢~还有一个问题就是2X HBS的PH的问题。因为不知道多少合适，我想验证那一个PH下可以滴度 更高。结果博后说太麻烦，让我直接做。现在只做了一个2X HBS加入细胞后第二天的液体的PH变化。我觉得这样很不准确的感觉~~但是也不知道怎么去反驳~~

telomerase

2X HBS
0 ^6 U# ^2 \2 k( o  T# o9 H8 k  S* I3 H2 s* N8 B' r% b/ p
280 mM NaCl-----8.18g / 500 mL
+ y1 Z, U5 N: K; ^- b8 M/ n0 D$ J& ^5 Q& V! W6 K% T. n/ ~0 _
10 mM KCl-----.18g/ 500 mL
1 f" ]9 o/ x6 O! [! g* U0 `5 q: g1 I, X5 R7 I5 C/ _: G
1.5 mM Na2HPO4 * 2H2O-----.2g of Na2HPO4 / 500 mL5 Z; w- c7 _6 k& s( g2 w/ ^
5 P$ V/ c8 e# m3 w( M( t4 V# \
12 mM Dextrose-----1.08g / 500 mL  
( W/ P2 n) w0 m2 x3 V0 j" s2 T7 n* D" _! v! u7 w
50 mM HEPES----5.96g/ 500 mL 7 ]. g7 v6 U9 l$ j! a6 X* D2 ~

2 l0 T5 S/ n3 S; MCarefully pH to 7.05 and raise to 500 mL volume. Aliquot and freeze.
2 n8 q" s9 Z) U3 }5 z) I2 K0 H是这个吗？没用过。。。。。。。。2 a2 s1 `6 x8 B8 H
但看配方PH是一定啊！！！' K' T. F& t& ]) b& N1 Q

daviddow

直接用lipo算了

daviddow

直接用lipo算了

huangcong1988

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% a! E/ E3 |% e; c' v# q. J5 d6 G1 \. I+ c% t$ \
我直接是收集的慢病毒里面加PEG8000（终浓度为10%），然后混匀后静置过夜，然后6000~8000离心半个小时，然后就得到沉淀，这样行吗？我看他们有的加蔗糖，不知道我加PEG8000有影响么？

huangcong1988

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- b% }# L; x! F' _' `
& Z& g  _$ \9 e; U, K2 h现在包毒基本就是 FuGENE HD和lip2000，个人用的是lip2000，觉得效果还行，转染过程跟普通质粒转染差不多，要注意的也就是telomerase说的那些

wangwang1987

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* j) u7 K. m7 |( V! r, K/ g
谢谢~~

xxh83121

大家的慢病毒载体都是从哪里买的？是已经包装好基因的还是空载？新手，望大家支持