关于慢病毒转染的几个问题咨询

wangwang1987

1. 刚刚在addgene买了几个plasimd. 但是又四个是以Tet-o 开头，有四个是以Ptight 开头.想知道有什么区别么.
0 }, n" R0 c6 J2 n: X% B/ D2. 各位有用psPAX2和VSVg 包装的protocol么？因为刚刚开始没什么头绪的感觉，不知道具体用量.0 B9 a$ [( i8 S$ Z: Y3 H

telomerase

我们用的是pMD2G的那个，过程差不多6 j6 D) S  D  J7 M
和包装逆转录的过程一样，我们用的是lipo，方法请参照lipo用法
2 h0 E) F7 O4 M2 n; ^' v8 r9 }* D$ F; R. @% p
要注意的是：" v+ h& x2 K- L) A" ]( M" y
质粒的比例比较重要4 m7 O! w5 a; N4 [$ I+ h* M& v
细胞的状态比较重要
: ?/ S9 z# `  l8 ]5 x6 _1 i4 j: m包完浓缩下，超离或浓缩柱& k7 G" e9 ]7 J9 T: M
感染时必需要加polybrene，离心效果更佳

wangwang1987

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1 V2 ^5 d4 C) E7 _, C
6 V. K9 G7 K* D  u! o! W3 f4 I$ Y, b谢谢~还有一个问题就是2X HBS的PH的问题。因为不知道多少合适，我想验证那一个PH下可以滴度 更高。结果博后说太麻烦，让我直接做。现在只做了一个2X HBS加入细胞后第二天的液体的PH变化。我觉得这样很不准确的感觉~~但是也不知道怎么去反驳~~

telomerase

2X HBS
- n7 ~. I- R  o6 y$ ~- g9 S  _+ U+ d
+ b2 S0 q6 u. p0 B9 k$ V280 mM NaCl-----8.18g / 500 mL
" Z7 Z- A! t4 d7 l1 W
6 \4 c9 i# C3 w& u10 mM KCl-----.18g/ 500 mL
6 u- h! z8 o; ~& t- g. h: r  S/ \* T8 K6 N$ [$ ~( b* d2 r
1.5 mM Na2HPO4 * 2H2O-----.2g of Na2HPO4 / 500 mL: m% {+ v( d: }( ]
8 Q# R" Y" o( r3 @2 R
12 mM Dextrose-----1.08g / 500 mL  3 o( w, _: ~  K" k' a
+ G: |6 B: s" a# P9 z; g
50 mM HEPES----5.96g/ 500 mL 7 E9 q  \, o9 |$ R  R

9 g4 `  u3 {( oCarefully pH to 7.05 and raise to 500 mL volume. Aliquot and freeze.
9 }! C- n& D4 r: a5 m# G是这个吗？没用过。。。。。。。。
7 L2 [6 y( [: `$ F0 \但看配方PH是一定啊！！！5 v& \1 j; d8 }, p3 m0 R: P" u

daviddow

直接用lipo算了

daviddow

直接用lipo算了

huangcong1988

回复 telomerase 的帖子" j6 o# a4 f$ t2 g7 C6 z
* H8 {  s+ C: `" t$ T2 k1 U
我直接是收集的慢病毒里面加PEG8000（终浓度为10%），然后混匀后静置过夜，然后6000~8000离心半个小时，然后就得到沉淀，这样行吗？我看他们有的加蔗糖，不知道我加PEG8000有影响么？

huangcong1988

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) N0 q) F6 n% t7 r
, c# B6 w4 L) x- x2 w6 s5 I( b0 r现在包毒基本就是 FuGENE HD和lip2000，个人用的是lip2000，觉得效果还行，转染过程跟普通质粒转染差不多，要注意的也就是telomerase说的那些

wangwang1987

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9 w0 `( p/ A2 b5 Q& D3 D: f) m# d# ]$ Y
谢谢~~

xxh83121

大家的慢病毒载体都是从哪里买的？是已经包装好基因的还是空载？新手，望大家支持