慢病毒滴度测定的疑惑

sizhengliu

各位好！我用3代4质粒系统（PLP1,PLP2,P-VSVG,融合EGFP载体质粒）同时转染到293FT（35mm皿）中，可以见到比较亮的荧光。但是在转染后48h和72h分别收集上清进行滴度测定（293FT铺24孔板），每天观察，4天内连一点荧光的影子都见不到！我不知道是哪里出了问题？路过请指教！

gact

感染病毒过程是什么样子啊？; N& Q6 l" O& K: ]

  d1 U6 ?& \! a0 q& ~加入多少病毒液，，细胞状态，覆盖率， 换液时间，，

daviddow

你用什么细胞做滴度测定？

wangyimei

病毒滴度测定的时候，你只需在48小时之后看才能看到啊，另外应该在高倍镜下仔细观察，荧光产生的不是那么明显的；若要是这样还是看不到你可以在72小时的时候再观察一下；还是没有的话，说明病毒没有包装出来，找找原因看，看看包装细胞以及质粒，转染方法以及比例有没有什么问题，有的时候荧光显微镜的汞灯要是用了太久的话不是那么敏感也不是太好看的
2 G& }" M- Q/ z, \. I

daviddow

wo 我觉得不是。GFP在荧光下是很亮的，48小时应该显示很亮。

sizhengliu

回复 daviddow 的帖子* K; j! t8 C" R& K# L9 O6 r3 O
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你好！我用的就是包装病毒的293FT细胞。

sizhengliu

回复 wangyimei 的帖子/ @+ w5 E5 f' a" M9 i. s7 f( z) J

8 v" \5 @3 I- t0 W" ?4 o5 X% O+ R谢谢!

sizhengliu

谢谢大家！后面我仔细查了各环节，对转染质粒的比例做了调整，这一次转染293FT细胞8小时就有荧光了。但是，在转染56小时后观察，数量和亮度均有下降。这一次不知又是哪里出了问题？还望继续指教！

细胞海洋

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; ^$ H% O& D0 n! [3 J
0 M2 E% t8 g) N% O建议你发新帖提问

huangcong1988

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7 W, o1 j; r: E- j* P- |9 ^$ `( `, |. D4 d# w- g" }( r$ ]
按理说，时间长一点，所包装出来的病毒量会更多一些，也就是说时间长一点后，荧光亮度会有所增加，但是，如果你的细胞状态不好的话，随着转染时间加长，细胞死亡，荧光会降低。% x) J) J" z3 {4 j* a
而且一般收毒48h就行，你怎么56h后观察？你是想收72h上清么？如果你想收72h上清，那么，你期间最好不要动细胞（如果你的293FT状态足够好），因为首先293FT贴壁就不是很牢固，你经常动细胞会使细胞脱落，然后在包毒过程中，不断动细胞，影响细胞包毒，所以，建议在48h看一次就行了，然后到72h直接收毒就行了