CIK的那些事儿～

deron

Hi，大家好，我是CIK，这是我的故事。
, Y. t4 C  E  H6 c( y我的全名叫做cytokine induced killer，细胞因子诱导杀伤性细胞，很长但是很形象的一个名字，从生物学意义上来讲我是一组多克隆细胞群，拥有一个几乎完美的击杀组合。目前从事抗肿瘤工作，有一些还算不错的成就。; m. l4 Y4 Z7 h: d
我的大哥LAK——lymphokine activated killer， Elizabeth A. Grimm等学者在1981年通过IL-2培养的方式，成功将LAK与抗击肿瘤联系起来【2】。当年的cancer research在9月份报道了这一发现。那时候的IL-2还叫TCGF（T细胞生长因子），也没有什么商品化的产品，都是Grimm他们自己制备的，使用的时候加入20%的体积分数。（每每思及于此，想起自己经常跟血清说的“执子之手与子偕老”之类的甜言蜜语，不管她信不信，我反正是不信的。）当时Grimm很霸气地说道“据我们所知，这是第一篇在TCGF培养条件下，人类自体淋巴细胞溶解新鲜实体瘤细胞的报道，而这也与我们先前在小鼠中的观察结果吻合。” 可以说当时大哥的出道轰动了整个医学界。3 V* ]' X, Q, E
紧接着第2年Grimm在Journal of Experimental Medicine发出了更全面的报告，综合讨论了LAK对耐受性实体瘤细胞的杀伤效果【1】。当时已知外周血白细胞（PBL）中的NK细胞可以溶解一些成系的肿瘤细胞，比如K562等，但是少有新鲜实体瘤细胞的溶解报道——而LAK做到了。当时的Grimm认为IL-2导致了PBL细胞毒性作用的表达，才会发生肿瘤细胞溶解效应。实验的数据显示LAK系统不同于已知的NK系统或CTL系统，可能包含很多非经典的细胞毒作用。8 E. U$ [# Z0 B( K% |# w, B7 B2 y
研究者对LAK的研究很快上升到分子水平。1986年，Joseph H. Phillips等在Journal of Experimental Medicine发表了关于淋巴细胞因子激活现象的解析【3】，主要着眼于细胞表面的CD3、CD56分子。当时的CD56分子还叫Leu19，因此Phillips主要研究了CD3-Leu19+（NK细胞）、CD3+Leu19+（T细胞）、CD3+Leu19-（T细胞）对LAK现象的作用，得出了LAK现象不是什么特别的LAK细胞介导现象，只不过是IL-2活化的外周血NK细胞引发的杀伤活性而已——换言之就是说CD3-Leu19+表型的NK细胞在体外IL-2的培养后发挥杀伤作用，而CD3+CD56+T细胞，尽管介导了低水平非MHC限制细胞毒作用，但是对LAK现象作用不大。
* i8 @% P8 p2 X6 Y& Z7 _* S同年，肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）登上science【17】。作为LAK的加强版，TIL拥有更强力的杀伤作用（约是LAK的50-100倍），且无需持续向体内持续输注IL-2（联合应用少量IL-2可增强其杀伤力）。但是培养过程繁冗不易稳定获取，以及不能保证肿瘤细胞的完全筛除，一定程度上限制了TIL的临床应用范围。
+ E, z6 u- z5 R' @. n与此同时LAK的培养工艺也一直在改进，Fritz H. Bach在1987年the journal of immunology报道了自己通过应用抗CD3、β-IL 1、IFN-γ和β1的思路【4】。
0 C) ?1 m2 S+ OLAK的经典方法：1×106/ml密度的细胞在含r-IL2的组织培养基中培养，细胞数第5d到达顶峰，第6d便急剧下降。
0 l8 G/ B3 T. b% _前人改良的LAK细胞方法：0.5×106/ml的较低密度起始培养，并每2d补充新鲜培养基和IL-2，将密度始终控制在1×106/ml以下，可以延长至14d。" Q! J- O) \* S9 w$ [
Fritz H. Bach改进的方法：预先在含有βIL1、IFNβ或γ的培养液中孵育两天，再用抗CD3和IL2培养，可以将培养周期延长至21d，并获得更多的细胞数。
, [* f7 ]- w  o, |. a" D& MFritz H. Bach认为CD3和IL2的加入，显著增加了LAK细胞活性增殖能力，βIL1、IFNβ或γ，则增加了培养中的细胞溶瘤活性。, ^) z9 T: W" }- W: n1 [. e
此时的LAK，伴随着众多其它细胞因子的参伙，淋巴细胞因子激活杀伤细胞的名号已经名存实亡。伴随着大哥的退役，我自然而然地被推上了抗击肿瘤的第一线。
% x0 Y7 U* v; ~8 y5 @91年，Schmidt Wolf建立了经典的CIK培养方式【6】。第0d，加入1000U/ml的人rIFN-γ，24h后，加入50ng/ml抗CD3、300U/ml的IL-2和100U/ml的IL-1。每3d补充IL-2和新鲜培养基。其中的rIFN-γ，对细胞杀伤活性具有增强效应，且只能是在IL-2 24h之前加入；CD3有促进增值的作用，对单个细胞的杀伤力没有加成；IL-1的单独使用无效，它对rIFN-γ和抗CD3起辅助作用。这种方法现在已经推广开来应用在很多实验室。如此建立体来的CIK培养，每次培养中的总杀伤能力是LAK细胞的73倍。而在组分方面，LAK细胞以CD3-CD56+NK细胞为主，不表达TCR重排基因；而CIK细胞则以CD3+CD56+细胞（正常PBL中含量1%～5%，体外可以扩增将近1000倍）为主，该细胞是由CD3+CD56-细胞分化而来【7】，且CD56抗原（NK细胞标记嘛）的表达与细胞毒作用息息相关。分别用CIK和LAK治疗肿瘤建模小鼠，发现前者生存时间明显延长，且有30%（LAK为0%）的长期存活率【7】。
" Q# O! _1 ~) x( o8 I. C2 X在LAK经历了风风火火的80年代之后，90年代的CIK也红遍了半边天，日本人在92-95年做了CIK的一个随机试验【5】，用以检测CIK的过继免疫治疗效果。结果发现CIK可以在无强烈排斥反应的前提下，降低肝癌术后的复发率，并延长术后无复发生存时间，但是不能提高整体生存率。
0 L* n7 V) @& @# X9 y" t1 D* V" c* u进入新世纪以来，我的工作方向逐渐针对化透明化。Y.C.LINN等研究了白血病患者自体CIK细胞的培养及细胞杀伤效果【8】，发现培养后CIK细胞的比例在7.6%～65%之间（中位值35.3%），这些细胞对急性骨髓白血病靶细胞有效，但无法作用于急性淋巴白血病。且效应细胞对自体或异体白血病靶细胞杀伤效果相近。同时研究者有提到从急淋患者体内获取CIK细胞难度要高于正常供者，这可能是由于CD3+细胞的起始比例较低，不过经培养后，最终的CD3+CD56+细胞比例两者无明显差异。而Y.C.LINN等在进一步研究后认为，CIK是一个理想的过继免疫治疗群体【9】——CD3+CD56+细胞群（约占30%）对肿瘤细胞实施即时的强力杀伤，CD3+CD56-细胞群（约占60%）杀伤力较弱，但可在体内增值并维持的CIK作用时间（可以向双阳性细胞群分化）。而一小部分的NK细胞群CD3-CD56+（约占2%），则负责搞定MHCⅠ型分子缺乏的肿瘤靶细胞——这部分肿瘤细胞可以逃逸T细胞识别，也可以躲开CD3+细胞的攻击，之所以这么说，是因为CD3+CD56+和 CD3+CD56-细胞群，尽管对靶细胞的杀伤作用无MHC限制性，也仍然需要通过其CD3-T细胞受体复合物来完成。而CD3+CD56+细胞群较CD3+CD56-细胞群而言，包含更多的晚期效应T细胞，后者虽然细胞毒作用不高，但是具有更高的增殖潜能。; s( b& g$ `  {) K) D7 g
与此同时，针对我工作中的抗原识别能力不足的特点，研究者为我配备了一个特别优秀的助手——DC。 Schmidt Wolf也在2001年证实“经致敏DC与CIK共培养后，可增强后者抗多发性骨髓瘤细胞群的能力”【11】。同时作者也提到多发性骨髓瘤患者体内的效应细胞杀伤力略弱，反映出患者免疫能力的衰退。而在2000年，Schmidt Wolf就已经通过脂质体转染技术将肿瘤细胞RNA转入DC细胞中，进而与CIK共培养，结果发现这种CIK细胞可以逆转肿瘤细胞（对CIK）的耐受【12】。
6 a( u6 a3 q# N8 M0 a! y- C; n( T而最近几年，伴随着新技术的拓展应用和所接触的事物逐渐多样化，我的工作能力水涨船高，应对范畴也渐臻广泛。John K. Chan应用双特异性抗体（BsAb），消除了卵巢肿瘤细胞对CIK细胞的耐受【13】。Virna Marin通过转染使CIK细胞表达抗CD19嵌合受体，增强对CD19+的ALL靶细胞的亲和作用【14】。而Steve H. Thorne等也提出以CIK为载体，装载已修饰牛痘病毒杀伤肿瘤的设想并验证成功【15】。9 D% E8 V6 r7 M
这些年，研究者已经发展出多种类型的杀伤性作用细胞并已经将它们用于人类癌症的细胞免疫治疗。无论是自体或者同种异体移植，无论体外或是临床研究，CIK的赫然崛起有目共睹。如果能够克服基因工程技术与药品质量管理生产规范相容性的挑战，基因工程技术的发展将很大程度上拓展CIK潜在的临床应用。; q6 K+ V) f0 }7 k0 h& L3 U
在目前肿瘤的免疫治疗模式中，我所扮演的通常都是辅助者的角色。从开始到现在，外界对我的质疑声从未休止过。他们认为缺乏体内免疫环境熏陶和磨砺的我，难以胜任阻击肿瘤这样艰巨的任务。无论如何，现在的我视那些声音为自己前进的动力，努力让自己尽快整合进入癌症治疗方案，以期提高癌症整体治疗效果——真正实现自己的细胞价值。One cell, one dream。: ^# h! g& R7 y
不管你信不信，反正我是信的。8 j1 `( M  \2 X8 U" P! S6 w

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deron

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附录
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0 ^3 `1 Y& \2 }" C2 g受启于
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deron

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& \. h8 q( U* f3 h7 T楼上的全文粗译版，仅供参考，请不吝指教。
1 ~6 N8 g0 u1 t- z6 Y2 q  U0 W! l, B( W( W3 r* i" ]2 Z

ziyunfei1982

正要开展这方面工作，非常感谢

aidiulgy9517

回复 deron 的帖子  O+ T+ E5 H2 y$ L# ~

: u* U/ p- E, {! n. x很好的自我介绍，谢谢分享！

zhangmingqi111

学习了，谢谢

forcat

非常感谢！！

drxia

学习了，谢谢!

hwlightning

我想请教下，CIK和NK的培养方式在哪些环节不一样？