取小鼠原代MEF消化时间是多少？？？

luyoude

我用13.5天的小鼠胚胎做MEF 37度胰酶-EDTA消化15分钟，结果第二天细胞全死 没几个贴壁的。是不是胰酶消化时间太长了啊？？我看文献资料上很多都说胰酶消化10多20分钟啊！！各位高手 你们做MEF的消化时间是多少啊？ 想看看大家的经验。。。

wuxiao101325

一般5min就可以了，建议参见http://www.stemcell8.cn/thread-16869-1-1.html

starlight

昨天刚做了两只小鼠的原代MEF，我的做法是：组织块剪碎后，放入20ml血清瓶中，加入10-15ml 0.25%的胰酶，轻轻吹打，然后放入孵箱消化沉降5-10min，这是第一次消化；消化后吸取上清，加血清中和，离心，离心下来如果血细胞过多，舍弃，如果MEF细胞量还可以，种到一个瓶子里；吸取上清后，加15mlD-hanks，吹打，沉降，吸上清，接下几次细胞都较多的，如果细胞比较少了，组织块还比较大，继续加胰酶消化下；我觉得不可用胰酶消化过长，否则对细胞损伤太大

ellapan

一般来说胰酶消化时间的选择上虽有一定的要求 但是像你这样细胞都死光光啦 我个人觉得不单是消化的问题了

科学家

可以在37°缩短消化时间，或者就在室温消化8-15分钟，消化过度会影响细胞贴壁和生长的

上海过客

发个 图看看 什么问题 。
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" W( I: ?3 j1 N, r我觉得 那细胞还挺皮实的 。  开始消化下来的细胞 好像有文献报道不太好。
) |. B1 o: G* S# \5 p( O剪碎的 组织块 在吹打过程中游离出的细胞较好
3 h4 ^! q1 F1 M0 p9 I6 ]  I0 K9 |' L( {; H2 {
胰酶浓度 0.05 我觉得 就够了 。 我觉得 你没注意这个问题。可能是用的浓度交大，试试低一点的浓度。

cortex

我觉得这个与你剪碎组织的大小有关。一般在37°消化，具体时间可以根据你消化的情况而定。一般一不出现大的团块为准。

zhangdagou

结合我自己的经验，我觉得楼上的几位取出的细胞比较少，我一般是一只老鼠的胚胎种植一瓶T75培养瓶的MEF，关键是剪碎，可以将胚胎放在1.5ml EP管里面剪碎，效果蛮好，楼上几位给出的消化时间比较短，这个是不合乎根据的，MEF细胞主要来自于鼠胚的皮肤，这个是很难消化的，0.25胰酶消化长则细胞死亡多，消化短则得到的细胞少，一般用肉眼判断，消化的时候发现皮肤变白，逐渐变糊糊状时候就可以了，这个时间一般在20min左右，还和胰酶活性有关，对于放久了的胰酶可以将时间变长点

wxl87

我们实验室都是消化5~10分钟，37度。然后多吹打

iseeyou1210

我们一般用多部消化的策略，先剪碎，然后用2ml的trypsin，消化3分钟，然后颠倒一下管子，然后2分钟，颠倒一下管子，然后一分钟，将上清细胞悬液转移到有DMEM+FSC的全培养基，然后重复2-3次同样的消化过程，然后离心，把所有的细胞放到T25中，一般第二天，铁壁的细胞大概count有8-12 million。7 Y* G7 M7 Y; ?
我说的从E13.5的embryo中提取MEF。