小鼠胚胎干细胞培养几天后贴壁不牢换液容易飘走怎么办？

天龙八部

我在明胶包被过的6孔板培养B6小鼠胚胎干细胞系，明胶包被2h，弃明胶后复苏小鼠mES培养，每天换液。换液前培养基平衡至室温。传代后细胞大量漂浮，类似EB球。没扔，观察了几天，没漂浮的零星几个克隆仍然在长，大部分漂浮的不再贴壁，像EB球一样。这个问题怎么解决啊？6 k4 x" ~/ D* |2 H! \' t
我想到的是换液前培养基平衡至37℃，和细胞温度相同，而不是平衡至室温。希望各位能谈谈自己的看法，谢谢！

康小纬

你上网查一下小鼠的胚胎干细胞有没有悬浮的，我们实验室养的大鼠的ips大部分都是漂浮的，只有少部分是贴壁的，这些都是属于正常现象，换液的时候就把上清液离心，然后用新的培养基重悬加入皿内即可

天龙八部

回复 康小纬 的帖子
4 F9 o; P5 D( [  g9 d
. g) P/ c; R" S" I谢谢！我再查查文献。不过目前看到的文献里没有用悬浮培养法维持小鼠mES生长的。只有培养EB球时用悬浮培养。

abcstem

回复 天龙八部 的帖子
- N0 M) W  e1 P5 k. \/ M; w/ A: H8 Q' V& I' b7 R
你用的什么培养液？含血清培养液，小鼠ES细胞是贴壁很好的。无血清培养条件下贴壁不好。

天龙八部

回复 abcstem 的帖子8 r! u& B" D$ T2 w6 s2 z
, b, A2 P3 f# j( n* Q; r1 G0 R
在MEF上养的细胞用的含有15% FBS的培养基；明胶上养的细胞不含血清。

abcstem

回复 天龙八部 的帖子
- z9 G& y# U1 W' k- H. t+ R/ }: |. h+ f: H4 W
无血清条件下小鼠ES细胞在明胶上培养时是贴壁很差的。

meredith603

为什么要在明胶上做ES的无血清培养？好歹也要换个细胞基质比如matrigel啥的吧，明胶太基础了。

splinkerette

回复 天龙八部 的帖子
! ]+ Q* l3 `* C- B. V  k, v% X' F3 Q6 |7 X6 y* p( T9 M1 y
小鼠胚胎干细胞的确没有用悬浮方式培养的。7 P. W- D9 Q! D& }) v, c9 w# `
无血清情况下贴壁确实很差。% w0 b0 J2 h  i8 e6 ~% r; \5 L, l
你是用的无血清培养基？是Austin Smith实验室的2i+LIF的培养基吗？

anning111

大小鼠的IPS都可以加点FBS让他贴，还可以加ROCK 抑制剂也行，如果要进行无血清培养的话，可加入KOSR，这个能让IPS、ES贴的

anning111

你可能用的培养基不对，你可能用的是DKO+2i,就是20%KOSR+2i,试试别的培养基。% N# S- N% s. `' h* V
' X# }& Q, H$ s( a- n0 v
1，用冰冷的0.2%gelatin5ml 铺在10cmdish,37度5分钟，这是采用热胀冷缩的原理将胶原固定在dish上7 Z  A, H% d% |& Y5 e. N& D
2，用BESM20%FBS+DMEM或者10%FBS+N2B27+2i贴壁过夜，
: B6 g3 f% w# e4 E# t! K3，第二天换上N2B27+2i 培养基$ H% J: O7 t  O% a
3 G# `$ B, o6 ~) \) K( f# m
保证细胞长得好