求指导NK细胞培养

yangpan521

哪位大神帮我看看这NK培养流程有没有不妥的地方，细胞数量上不去，着急啊9 J8 z0 O! m5 x
培养材料：
8 c# u. [& @/ _, i: i2 B无血清培养基GT -T551、生理盐水、淋巴细胞分离液Ficoll、人血白蛋白、自体血浆" Q0 A3 W( l* g8 @6 }2 e
细胞因子：IL-2（1000IU/ml）、Anti-Human CD3（5ug/ml）、IL-12(500IU/ml）、IL-15(500IU/ml）
! z& T& Z  ]) u操作步骤：) d  H1 q. T6 I% a& ~
1、采血机采集外周成分血50ml ，用生理盐水1:1进行稀释，
. n" I% |; w3 o) P! m$ J( \6 O2、由Ficoll液分离，去红细胞，收集初步纯化的单个核细胞：经Ficoll液梯度离心分离单个核细胞，Ficoll液与待分离的单个核细胞悬液比例为3:5分离方法: 取新的50ml离心管，没管加入15mlFicoll分离液，将25ml单核细胞悬液，贴壁轻轻加入管中Ficoll液液面上，注意单个核细胞悬液的加入不能打破离心管中Ficoll液的液面，离心2000rpm/min，20min，升速1，降速0，离心后，液面分为四层，小心吸取第二层的单核细胞层，用无血清GT-T551洗涤2次，离心1800rpm/min，5min，20℃，弃去上清，再用5ml无血清培养液混悬。& O% `3 {; x% u7 J! R# N
3、细胞计数：吸取约200ul的细胞悬液与1.5mlEP管内，另取一个新的EP管加入90ul台盼蓝和10ul细胞悬液，用血球计数板进计数。
& }% C- V, B; s% B8 p) `& z4、将PBMC密度调整为2X106/ml，转入T75瓶中，培养基加入CD3McAb、IL-2、IL-12、IL-15，并置于培养箱中培养。每隔3d半量换液，并补充相应的细胞因子和自体血浆。2 P! f  n. l# _6 U
5、收集悬浮细胞：培养第10d观察NK细胞并收获NK：将培养瓶内细胞悬液转移至50ml的离心管中，1800rpm,离心5min。去上清，用生理盐水再洗细胞2遍，最后将细胞组分混悬在100ml含1%人血清白蛋白注射用生理盐水中，转入细胞回输袋内，制成NK回输液。! w2 `9 ^( q" Y1 ?

yangpan521

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5 l' M9 U7 ?1 T% _( D+ \
9 ^8 V7 s6 B2 x2 W6 x/ O90倍，有的低，都说可以扩大120倍，也不知哪出问题了

yangpan521

回复 wind789 的帖子
: A% w9 a. W  `. `4 N% Y* ~- m4 P! ^" a: j, y7 t6 X
20%左右

yangpan521

回复 gondobar 的帖子0 i- h" J& T  i! S6 b, f- b
% g, S+ o2 Q  H7 c9 }! g/ D
请问我上面的培养不骤没什么问题吧

yangpan521

回复 jianglei_sd 的帖子* Q& Z% c( z9 t/ Y9 N) D$ N& @

) a7 O) H" p% x' ^+ v还在摸索阶段，请指导

yangpan521

回复 gondobar 的帖子" Y: H$ s; _1 w0 Q+ d

6 G3 ]. m6 O! M7 J2 e$ v请问你是怎么分离的，我还在摸索阶段 ，有很多问题，请指导，谢谢

yangpan521

回复 pppjjj 的帖子
& a% M- E% D  ^$ A
3 r! |" e$ s- r" _9 Z3 q不是，还要转袋培养