求指导NK细胞培养

yangpan521

哪位大神帮我看看这NK培养流程有没有不妥的地方，细胞数量上不去，着急啊5 j* ]0 s3 f  k: j8 Z) t1 B
培养材料：
* E. Z3 E& q4 c无血清培养基GT -T551、生理盐水、淋巴细胞分离液Ficoll、人血白蛋白、自体血浆
' r1 z6 g& t6 U! S细胞因子：IL-2（1000IU/ml）、Anti-Human CD3（5ug/ml）、IL-12(500IU/ml）、IL-15(500IU/ml）
; m2 J! w# d! V; q4 D& @5 z操作步骤：
' U( I( h  b* _7 s+ s1、采血机采集外周成分血50ml ，用生理盐水1:1进行稀释，2 W* _5 z, K7 C5 {& J" y1 P
2、由Ficoll液分离，去红细胞，收集初步纯化的单个核细胞：经Ficoll液梯度离心分离单个核细胞，Ficoll液与待分离的单个核细胞悬液比例为3:5分离方法: 取新的50ml离心管，没管加入15mlFicoll分离液，将25ml单核细胞悬液，贴壁轻轻加入管中Ficoll液液面上，注意单个核细胞悬液的加入不能打破离心管中Ficoll液的液面，离心2000rpm/min，20min，升速1，降速0，离心后，液面分为四层，小心吸取第二层的单核细胞层，用无血清GT-T551洗涤2次，离心1800rpm/min，5min，20℃，弃去上清，再用5ml无血清培养液混悬。8 k( N- O0 v- {4 e# h% T# w
3、细胞计数：吸取约200ul的细胞悬液与1.5mlEP管内，另取一个新的EP管加入90ul台盼蓝和10ul细胞悬液，用血球计数板进计数。1 d* g$ s) f: t$ ~6 e
4、将PBMC密度调整为2X106/ml，转入T75瓶中，培养基加入CD3McAb、IL-2、IL-12、IL-15，并置于培养箱中培养。每隔3d半量换液，并补充相应的细胞因子和自体血浆。
. a+ R9 [2 K6 V( d4 U/ J1 C% n5、收集悬浮细胞：培养第10d观察NK细胞并收获NK：将培养瓶内细胞悬液转移至50ml的离心管中，1800rpm,离心5min。去上清，用生理盐水再洗细胞2遍，最后将细胞组分混悬在100ml含1%人血清白蛋白注射用生理盐水中，转入细胞回输袋内，制成NK回输液。
. T+ J4 c! ?5 U! {  i

只因偶然

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4 i* Q  v/ j& _你是陈林？

guanjun1314

这种方法，90足以满足要求了吧

细胞海洋

回复 yiyuan0530 的帖子% a. D4 E. z" v3 s: N

! a! A6 Q2 m) T有问题请直接发帖

chenlin080102

因子配方还有待优化，我的能增长120倍，纯度近70%

mengnancy

两步法细胞回收率会更高,50ml血可分离到3*107以上,可以试一下.

mengnancy

两步法细胞回收率会更高,50ml血可分离到3*107以上,可以试一下.

mengnancy

可以用羟乙基淀粉沉降红细胞后,再用ficoll分离单个核细胞.

mengnancy

基础培养基用LONZA的x-vivo培养基培养,试过之后NK比例40%左右.

六弦七品

加液就行了，不用半量换液。