脐血MSC的分离！为何Ficoll的单核细胞层如此不清晰？（附图）

huajie881026

做了几次脐血的MSC的分离，每次用Ficoll分离时白膜层（MNC层）都不是很清晰，并且这层很宽。为什么呢？有没有谁也遇到过类似的问题？取白膜层的话有要取这么厚一层吗？困惑！！！我用的是GE的Ficoll  1.077的（借的别人的），用500g 、18℃离心30-40分钟，自己买的Ficoll  1.073的还没送到（看Ficoll的说明书上说1.073的适合分离MSC，因为MSC的密度更低）。  z& Y4 T* k6 S$ Z: W3 Y" W9 t
到底什么原因呢？？？ 6 N% a' o! @/ Z5 A+ K2 l* d8 w
$ }) y, z/ j4 x5 \$ g" T% l9 Z. C
附上Ficoll说明书
  c( h4 k5 l* c! I7 s5 z: b4 d( \

pailishi

这个肯定不对，应该是很薄的一层，白色的

huajie881026

pailishi 发表于 2012-7-24 12:11 1 |2 k6 l( q1 d% a% K% B
这个肯定不对，应该是很薄的一层，白色的

! k6 B3 u8 w+ ?/ [; [
哪里做错了吗？求指点！困恼啊。。。

小猪快跑

你是按说明书上操作的吗？他给你的分离液有没有过期啊，还有他用过之后是不是保存在四度冰箱里啊，正常分离出来的四层分界还是很明显的，要提取的细胞量多的话白雾层是比较明显的，不像量少的时候那么模糊，但是条带不会太宽的

wangzhiqi86

1.不知道你的500g是多少转，3000 rpm左右吧
0 P8 D4 R' L! F0 W! w: I2.离心开始和结束时都要用最慢加速度和减速度的程序3 z' `" i& Y4 u
3.细胞悬液要逐滴加到Ficoll上面，一定要慢，不能混合
7 i4 B6 J4 e" D- ?1 v( B: c  f4 Q) m4.确实要取白膜那一层，因为MSC就在里面，你轻轻摇晃50 mL离心管可以看到白色层在轻轻晃动
" D& \( v/ m" Q. Y% @* R5.1.077g/L的比重分离MSC没问题

huajie881026

wangzhiqi86 发表于 2012-7-24 13:56 : ~8 x+ G4 i5 K; P- q! M
1.不知道你的500g是多少转，3000 rpm左右吧
8 ]' |2 M- X* {( b0 s2.离心开始和结束时都要用最慢加速度和减速度的程序
! l8 ]: ^) a2 J3.细胞悬 ...

# K. q$ h$ {( c/ W  n% A& l% o
1、我这边的500g是1667rpm，400g是1491rpm
; E6 u4 B) T! x8 m7 P2、离心开始和结束时都用了最慢加速度和减速度: S: |1 b! q: W: c9 P# Z7 X6 T$ g6 G
3、细胞悬液是逐滴加到Ficoll上面的，每次三管50ml离心管加满都花我30分钟，已经很慢很小心了5 \6 D! w; A6 [8 e* U: S
4、我的确是看到了白膜层，但是上下界限不是很清晰，是怎么回事？# L& T6 Q* C6 n# C( _6 _: R" r
5、1.077应该是没什么问题，我看文献和论坛里大家也都用的是这个，但是GE  Ficoll说明书上说1.073的更好，更适合分离MSC
1 a1 V  b' O- P( a& x9 P- D% q# D, w0 V) h  l/ |
请教大侠：会跟肝素抗凝了有关系吗？因为临床的脐带血他们抽的时候都是2ml肝素钠（12500单位）抗凝这50ml血的，肝素钠是不是有点多了？! ^! F. p3 D+ @- n. P9 J  y

" \3 d) \  Q7 m0 c$ |9 ]* g2 N还有做的时间有限制吗？我一般都是拿到脐血后6-8小时开始做，是不是应该拿到脐血尽快就做？

huajie881026

小猪快跑 发表于 2012-7-24 13:47 9 e' r5 y- H- l
你是按说明书上操作的吗？他给你的分离液有没有过期啊，还有他用过之后是不是保存在四度冰箱里啊，正常分离 ...

2 M$ l/ }, o/ s4 M9 M, _7 e
是的，完全按说明书上操作，分离液没过期。
2 k5 e' k1 D' N: w6 |, m他都是室温下保存的（25℃），因为Ficoll上说4℃-30℃保存，并且要避光，放冰箱的话别人开啊关的会有灯光影响，所以都放室温保存，这会有影响吗？
( ^1 ^. S! @' W肿么办？白膜层不对劲啊！！！

Roden

目测有两个个问题! O' e0 x  ~! e8 l4 ]
1.血液是否稀释，比例多少？
/ g2 Q" c0 Y# G0 Z. f! W* k2.淋巴细胞分离液与稀释后血液比例为多少？

ly200101042

我觉得离心时间偏长了，我们这一般是20min% ~& n7 F, K) U0 n. J) N
还有得注意下血液的稀释比例和淋巴细胞分离液与稀释血液的比例，我们这一般是血液稀释一倍，稀释后淋巴细胞分离液与稀释血液的比为1:1或1:2。2 p+ f/ F) n, {/ P
肝素抗凝不会有影响的。

huajie881026

Roden 发表于 2012-7-24 15:23
' y& w7 k( I' }目测有两个个问题
" S% t$ ]7 s; {2 s* u4 b1.血液是否稀释，比例多少？
$ |* K8 X7 }' _9 W2.淋巴细胞分离液与稀释后血液比例为多少？

, }+ ~7 [" {0 B
1、血液与PBS1：1稀释的，50ml血与50mlPBS混匀的
$ o) f. t! E& l) l2、淋巴细胞分离液与稀释后的比例为1：2，即我每次拿50ml脐血，与50mlPBS稀释，最后用50mlFicoll来分离，所以这方面应该没有问题吧。