脐血MSC的分离！为何Ficoll的单核细胞层如此不清晰？（附图）

huajie881026

ly200101042 发表于 2012-7-24 15:37
# j( I1 s$ w$ W我觉得离心时间偏长了，我们这一般是20min
! q! c$ x  Y3 F5 k6 \9 f* }还有得注意下血液的稀释比例和淋巴细胞分离液与稀释血液的比例， ...

8 r9 c- S# v' ^关于离心时间我一开始是20分钟，可是出现这种情况后，我查了Ficoll的说明书说要30-40分钟，可是出来的结果还是一样，我就很困惑了。。。
: Y8 v$ a  y' M血液是等比PBS稀释的，Ficoll与稀释后的血液体积比是1：2

crazytime

你试试将血液离心后，去除学清，用盐水稀释下，另外分离液离心时速度升降一定要调到最慢，基本上就是自然降速
4 \: c$ l0 o( }' B  O

huajie881026

crazytime 发表于 2012-7-24 16:24 ! C7 k% E( A: n, p7 _" Q* X
你试试将血液离心后，去除学清，用盐水稀释下，另外分离液离心时速度升降一定要调到最慢，基本上就是自然降 ...

' [8 ]( d/ ]2 f$ _嗯  我下次尝试一下这个方法。
( C* W  u8 T0 w: p) _离心时速度升降我都调到最慢了。。。

meixue1130

根据说明书上建议的离心力附近，多设几个离心力试试，找到最适合自己实验室的离心机分离的离心力。同样的方法，不同的型号，不同牌子的离心机分离效果有很大的差别，所以得多做几次实验找到最适合自己使用离心机的最适条件。

happyending

离心力500g太小了

wangzhiqi86

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% w+ b; J( z9 L6 b2 }& s* H" {! b9 u3 N: ]& d8 U. y  B1 z
我做的是骨髓的，和脐带血的可能还不一样。0 e& `- C* j' T
我之前也尝试用肝素来防凝血，但没用，最后索性直接用PBS去冲骨髓了。
) B. e' t0 a2 {+ g" k: \个人觉得是转速不够，该离的没有离下去，我用的实验室的分血程序，2790rpm，它们是用来分造血干细胞的，也有有文献报道是3000rpm，你不妨一试。

神经干

我觉得有两方面原因，其它的我看过了，一方面离心时间和转速问题，另一方面是FICOLL，你可以换另一种进口的分离液试一下。我们之前出问题一般都是调这两方面，其它的我觉得没什么问题

huajie881026

wangzhiqi86 发表于 2012-7-24 19:55 9 @' N/ b5 _. u1 |" S' r
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( C2 a$ h5 N+ y9 W5 W3 K
& i- `; Q  J* V9 ?4 q: M  B我做的是骨髓的，和脐带血的可能还不一样。

: H: ]7 T/ h, w( K3 y嗯  好  我下次提高转速试试，谢谢指点！

huajie881026

神经干 发表于 2012-7-24 21:06
; k+ h+ M9 T) m) M( |, K我觉得有两方面原因，其它的我看过了，一方面离心时间和转速问题，另一方面是FICOLL，你可以换另一种进口的 ...

9 m" o* D! _; K5 l5 r8 \  w离心时间和转速我会再尝试，Ficoll我用的GE的，已经很好了吧，还有什么牌子的啊？比GE更好吗？可惜我已经订了GE的1.073的Ficoll。。。

wang66

我之前做脐血单个核分离也出新过这种情况，白膜非常不清楚，有个学长让我改用15ml的离心管后就好多了，你可以试试。3 i; g" Q, T. \; I) N' k, V* L# K6 A
个人感觉50ml离心管的液面比较宽，细胞少的话白膜基本就薄得看不见了，用15ml的液面窄一些，相对白膜也就会厚一些，比较明显。