脐血MSC的分离！为何Ficoll的单核细胞层如此不清晰？（附图）

huajie881026

wang66 发表于 2012-7-24 23:45
. L( ?( ^- \9 P! c( u7 l$ d我之前做脐血单个核分离也出新过这种情况，白膜非常不清楚，有个学长让我改用15ml的离心管后就好多了，你可 ...

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我一开始也想过可能是这个原因，因为50ml直径粗，高速离心时它是倾斜的，所以可能导致白膜层不清晰。我想改成15ml离心管，可是这样的话就需要10个15ml离心管，离心耽误的时间很久唉。。。要1个多小时，而且取的话也要10管分别取白膜层。唉，我打算下次用15ml的试试，希望可以成功$ H* |2 z  R8 b: v8 L6 d
感谢指点！

wcforever126

回复 wangzhiqi86 的帖子. \% D( x0 B6 T3 T8 _

" e0 c# u* b4 n; v您好，小弟最近开始提人骨髓间充质干细胞，师姐教我用生理盐水代替PBS，不知道对细胞有影响没？还有，能不能麻烦您把您提细胞步骤说一下，不胜感激。谢谢

wangzhiqi86

都是等渗作用，只是PBS的离子更多而言，没有太大差别，提取的步骤很多文献都有报道，你查查看。

wcforever126

回复 wangzhiqi86 的帖子5 z* y! Y& b) E! X
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麻烦看下小弟提取HMSCs步骤有没有问题：骨髓：生理盐水=1:1，Ficoll-Paque PREMIUM（密度1.077）：稀释后骨髓标本=1:1，离心2000转，15分，20度，最大加减速4/3，中间白膜用生理盐水稀释至10ml，1500转，8分钟，4度，最大加减速4/4，重复2次，加培养基。
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wangzhiqi86

回复 wcforever126 的帖子
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离心转速3000rpm没问题吧，个人觉得加速和降速应该用最慢的，因为这是密度梯度离心，重要的是保持每层细胞在淋巴液里面的稳定性，太快了容易造成各层间的混合。4 V2 @4 b% f1 }+ ]* Q
中间白膜层直接加到培养基里培养就行了吧，不知道后面再次离心的目的是什么？

wcforever126

回复 wangzhiqi86 的帖子: z+ K/ f. _( n8 g( C( c1 H3 `
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请问您说的最慢加减速度是多少？我们一般用最快4，最慢3，提出来的不是很明显

wcforever126

不同实验室离心机不一样，按文献上转速照搬是不对的，离心出自己想要的细胞，离心力是比较准确的，可以参照，不过还要根据自己实验室的离心机找出合适的离心力，故离心一定要找出适合的。

透明之蓝

回复 huajie881026 的帖子$ j6 L8 F# v9 |  P0 M
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1.073的更好，转速2000-2500，离心20min即可~~

zuoxin

这个白膜层是从20ml到15ml吗   你ficoll是加了多少ml

deshenglll

不晓得你哦。按你说的稀释比例是没啥问题。淋巴分离液与稀释后的血样的比例要按说明书上说的做。# o- B+ h+ _3 ^: `( X
好像血浆和红细胞层挺厚的。