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1.操作方法：. S: C _6 E- d: v1 q8 V
组织要剪得小，1个立方毫米左右。- k. Q t. B6 _4 J, |
f& v1 y" ]# e! Q+ S8 Q组织块要一个一个的点在培养皿上，每一个组织都要放实，就是组织充分和平皿接触，但是过程要快一点，不要让胶质干了。2 G) R- T. y' O, q, w: m# p7 _9 B$ _5 m& G$ d ^, M1 k
把放好组织块的培养皿放置在培养箱里静置，大概2小时左右，看组织块大小情况，目的是让组织块粘附在平皿上。
9 P2 k# e" k, c- m组织块粘好后，加入含血清的培养基，血清一定要好，进口的胎牛血清，一般10厘米的平皿，加8-10毫升培养基。' u5 y8 W, \/ `& y
0 r' l, P5 s( c6 O- P加培养基的时候，慢慢的加，不要把组织块冲起来，轻轻晃动，让培养基分布均匀。
' s4 y2 N+ h3 s" k加完培养基之后，把平皿放到培养箱里，大概7天以后再拿出来看，这期间，只开培养箱看看液体有没有变浑浊，是否污染，不要挪动平皿，更不要频繁拿出来观察。# ~) c$ ?1 m/ o* I! Q:如果都做到了，期待是新鲜的，基本不会有什么问题，我这么教师妹做，个个都做的出来。
( N& Z* p+ N- l6 L! w, C* Q+ j需要注意的是，组织块不要用PBS什么的洗来洗去，会降低胶质的粘附能力。7 j6 s, Z* v6 W9 T; 脐带在解剖前做好灭菌，我们用的是75%乙醇，之后大量PBS清洗。9 x! _7 D' F' k
从开始解剖分离胶质，组织就不能再和液体接触了，不然组织都贴不上。
6 n9 Y1 B Y) C5 |& J0 V+ E& M除了分离血管，羊膜也一定要去除，那个东西很致密，细胞不容易出来的，而且也不怎么贴壁，除非你能保证你用组织块贴壁的时候，接触平皿那一面肯定是胶质。0 w3 k# D( ]) D* \ e- N& b; r' D2 a( b! p+ _
最后再说，血清很关键，普通的GIBCO根本不行，我试过，很难长出来的，对于新手来说，一定要用高品质的进口胎牛血清才能保证细胞爬出来的多。/ s5 w8 [+ k" `5 {- w1 t
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2.组织块贴壁法，顾名思义就是要让组织块贴于培养瓶细胞面上，如果都是漂着的，细胞根本不会生长。你可以将组织块剪碎后均匀铺壁，待贴壁几个小时候后再缓慢加入少量的培养液。这样细胞就容易从组织块中爬出细胞。1 b+ n+ m( o' {0 g
) E/ v4 x8 ?2 G) n3.铺瓶后不要直接加培养液啊，不然肯定会直接飘起来的，铺瓶后应该倒置培养4~6h（或过夜）后在加入培养基正置培养，一般7~14d即可会看到细胞爬出。- n A8 T5 X6 K
- h8 L' P* |0 l7 J2 D* i- x/ p6 W$ L4.还有 就是在运输过程中，脐带都是浸泡在生理盐水加双抗中，大概2个小时左右，做之前也是哪pbs冲洗一下。之后也没有pbs反复冲洗，是和浸泡的时间长有关吗？
# L2 T3 O1 a6 K不知你的双抗浓度是多少，我觉得抗生素对细胞也是有一定的影响，如果你用的抗生素浓度大，而且还没有好好洗涤的话。( w$ n6 B$ u8 }2 O) x4 Q, ~
# h% M1 p! g/ x+ I4 \1 r$ L至于运输两个小时，影响倒是不大，我做过放了将近十个小时的，也是可以出细胞的。4 y/ C1 M2 c# A2 R0 A7 r9 z4 j0 t& h7 W
你应该还是从你接种组织块的手法，还有培养基和血清方面找找原因。' ]# F+ \, {: k+ k/ x: m$ `# b
血清很关键的，我曾经用GIBCO的普通血清，做了一个多月，好几例，死活就是不出细胞，后来换了德国的一个胎牛血清，7天就有很多细胞出来了。好像海克隆的胎牛也不错，可以试试。+ Y) e, P3 j% p2 q# S. m; F; B
6 z0 f2 y" {! p2 @如果是下午做的（3、4点钟）一般会过夜后第二天早上添加培养基再正置培养，如果上午做的完全可以倒置4~6h后再添加培养基即可；即使是过夜后添加培养基胶质也不会干的，因为是在培养箱内倒置培养的，又不是室内环境，我们一直都是这样做的，好几年了没有问题。
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1.组织块尽量小一点，我们实验室用的组织分离器处理，组织块基本上都分离成组织匀浆，培养效果不错。
4 v, `' j' S: C' x2.还有就是加入的培养基的量，只要能刚刚浸润组织块即可，不要加入过多，造成组织块悬浮，这样细胞很难爬出贴壁的。 k: K& ~' c) Q7 C
5 Q Y% v( R+ z; N3 u4 ]3.分享一个小技巧，可以先在培养瓶中加入少量的培养基，以25cm2为例，一般加入1-2ml即可，然后再加入处理好的组织块，3 v. S8 X& Z1 S1 O9 Q9 |; k; ^4 ], |7 A- Z' |9 L% H3 H- v, _
这样可以避免后加培养基将组织块吹散起来了可能性了。
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. e3 x/ {& \, j! y( N0 {* P6 ?先分离华通式胶 剪碎 这个是越碎越好 平铺在培养瓶上 放培养箱干4个小时 然后再加培养基 按照组织块培养费 換液培养 这样可以解决你的贴壁问题 用干贴壁做 组织块能贴得很紧的 但是后续操作要轻拿轻放 不要让组织块被培养基冲下来；其实 由于华通式胶含间充质纯度高 用一般组织块贴壁法做 即使贴壁不好 也能长出细胞 只是细胞爬出多少的问题，你如果真的是没有细胞爬出 很有可能是你的培养基体系问题；我是脐血库的 天天养脐带，应该是这样8 E/ w4 k% Z- p8 I5 D* U" s. o
$ L/ X3 E a# X! W. Y$ s- n$ Q那你们比较厉害，请问脐带是怎么保存的？我做过的都是24小时之内就分离培养了。
& r0 E0 X6 {) r我最近在考虑以后要不要给孩子存干细胞，要是脐带放半个月也可以分出干细胞，那我估计我可以在实验室自己做。# F& j& e* G$ W, |* e) K3 H2 |: j$ d4 Y+ |: D3 {
看前面你说自己是脐血库的，有几个很好奇的问题，你们养细胞用什么培养基？用不用血清？还有就是你们用胶原酶么？我感觉胶原酶分出来的细胞没有组织贴壁的好，你应该做的比较多，有什么体会？7 b. g+ _6 F0 M2 K$ Q
2 U5 j/ V4 a. C1 C* ~肉泥只适合做干贴壁法吧，常规组织块法做的话 你剪这么碎基本长不出来细胞的，剪成2-3mm差不多，太大太小都不利于贴壁 这个只有你慢慢摸索了。
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' M, }* h- i* ]0 B1 z我是以前收集的一些资料，分享给你！ |
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发表于 2015-11-22 12:37
