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4.1 抽取患者外周血200ml(或机采80ml) ,转入50ml离心管,用生理盐水按血样:生理盐水=1:1的比例稀释混匀;# R0 h' m! o8 D6 i
4.2将淋巴细胞分离液(密度1.077)加入50ml离心管,每管加入20ml;
" I9 W+ P5 H4 b6 L& D% d q, N 4.3将稀释血样缓慢加到淋巴细胞分离液(上步准备好的)上面。(加样时注意:将离心管倾斜45度左右,在淋巴细胞分离液液面以上1cm左右处,缓慢加入稀释后的血样,不要打乱液液界面)。稀释血样量:淋巴细胞分离液量=1.5:1,室温下,于2000rpm(或800g) 离心20分钟,注意离心机升速和降速都调至最低;: r7 Q( k& C8 b1 e4 ~
4.4用平口巴士吸管轻轻插入到PBMC层(即白色细胞层),沿管壁小心吸取该层细胞到另一支50ml离心管中,用生理盐水调体积至50ml混匀,1500rpm(或400g)离心6分钟洗涤2遍,洗涤最后一遍时取样计数、计算活率;
& ~: y) q) Y( g5 R0 |4.5弃上清,细胞用80mlRPMI1640培养基重悬后接入T75培养瓶中,每瓶接20ml。用记号笔做好标记(主要标记病人姓名、生产批号、接种日期、操作者姓名简写)后置37℃、5%CO2培养箱孵育1小时;
2 P- [4 k' q4 v0 }3 F( r4.6轻晃培养瓶,收集悬浮细胞于50ml离心管中,然后用无血清RPMI1640培养基洗涤培养瓶中的贴壁细胞2遍,洗出的细胞与前面收集的悬浮细胞合在一起(用于制备CIK细胞),然后向培养瓶中加入DC细胞初始培养基后置于37℃、5%CO2培养箱中培养;% k$ x( n/ U! \2 O; h2 A
4.7第3天开始视细胞生长情况补加DC细胞维持培养基;
2 T/ C, h" J6 E9 j3 ?+ g9 ` 4.8第5天加入肿瘤抗原(终浓度1%);
5 P1 H4 \5 }1 |1 X4.9 第六天加入H,取样做细菌、真菌检测;
6 I5 Y1 b, H& k0 V% ?4.10CIK培养
- C6 i9 x5 D, \) k O; f4.10.1取4.6步中的非贴壁细胞用于CIK细胞的培养。离心收集细胞,用CIK初始培养基按1-2*106/ml的密度重悬细胞接种于培养瓶(少于100ml时)或培养袋(多余100ml时)中,置于37℃、5%CO2培养箱中培养;" k" C, Z" [7 ?! P0 w/ i6 j
4.10.2以后每天观察细胞状况,并根据细胞生长情况补加CIK细胞维持培养基;
5 t+ ~: @) s! r7 [0 R4.11DC-CIK共培养用
% F2 I+ r. J9 L* w 4.11.1收集培养至第7-8天的DC细胞,按DC:IK=1;10-1;100的比例将DC细胞分配到CIK细胞中,并补加B,培养过夜后再次补加B;
. l5 |9 v0 C% n& E$ D6 T8 m4.11,2以后每天观察细胞状况并根据生长情况补加CIK细胞维持培养基;6 ?* g7 @- F% R" e- x g/ Y
4.11.3第9天,观察细胞生长情况,预计回输日期,在预计的回输日期前2天取样做细菌、真菌、内毒素检测;
0 |$ H% z* l, o' N/ B) m4.12回输
& C' w# k4 N- p1 i0 \! v6 v! @4.12.1首先观察细胞生长状况,观察有无污染,结合细菌、真菌检测结果确定是否适合回输。
" r' W0 C0 e8 M+ A A4.12.2如果适合回输则收集细胞。将适量细胞培养悬液至50ml离心管中(根据细胞总数和生长状况确定每次收集的培养悬液的体积),取样计数、计算活率。1500rpm(或400g)离心6分钟,上清留样两份,一份用于下次细菌、真菌、内毒素检测,另一份冻存于-86℃冰箱备查(保存至回输结束后三个月),其余的弃掉,沉淀在掸散后用生理盐水洗涤2遍(1500rpm离心6分钟)后用含2%人血白蛋白的生理盐水重悬至100ml,做好标记(主要表病人姓名、生产批号)后,填写好相关记录后交护理人员送病房回输。
3 M+ Y8 ]) a3 B$ \1 _6 N6 [5 W4.12.3剩余细胞视情况补加CIK维持培养基继续培养用于以后几次的回输。
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