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1 抽取患者外周血200ml(或机采80ml) ，转入50ml离心管，用生理盐水按血样：生理盐水=1:1的比例稀释混匀；
; Z* F- D. ~0 W8 z9 A& P% e2将淋巴细胞分离液（密度1.077）加入50ml离心管，每管加入20ml；' T% t& g- {. J7 z! y/ h
3将稀释血样缓慢加到淋巴细胞分离液（上步准备好的）上面。(加样时注意：将离心管倾斜45度左右，在淋巴细胞分离液液面以上1cm左右处，缓慢加入稀释后的血样，不要打乱液液界面)。稀释血样量：淋巴细胞分离液量=1.5:1，室温下，于2000rpm(或800g) 离心20分钟，注意离心机升速和降速都调至最低；
# s. p; q, C3 z6 x* v) A 4用平口巴士吸管轻轻插入到PBMC层（即白色细胞层），沿管壁小心吸取该层细胞到另一支50ml离心管中，用生理盐水调体积至50ml混匀，1500rpm（或400g）离心6分钟洗涤2遍，洗涤最后一遍时取样计数、计算活率、送样流式检测；% N$ _+ v1 ]0 r" T4 K' E" ~ I
5弃上清，细胞用80mlRPMI1640培养基重悬后接入T75培养瓶中，每瓶接20ml。用记号笔做好标记（主要标记病人姓名、生产批号、接种日期、操作者姓名简写）后置37℃、5%CO2培养箱孵育1小时；: Y, I" w8 n( g! d8 s) A
6轻晃培养瓶，收集悬浮细胞于50ml离心管中，然后用无血清RPMI1640培养基洗涤培养瓶中的贴壁细胞2遍，洗出的细胞与前面收集的悬浮细胞合在一起（用于制备CIK细胞），然后向培养瓶中加入DC细胞初始培养基后置于37℃、5%CO2培养箱中培养；
9 A0 _0 E+ w) U& h3 O7第3天开始视细胞生长情况补加DC细胞维持培养基；9 B5 Q4 |5 s5 b
8第5天加入肿瘤抗原（终浓度1%）；% [' T4 q, w! U2 \3 B, S" H3 g
9 12-16小时后加入H，取样做细菌、真菌、内毒素检测；
- @7 m9 W9 o) X; y2 M$ i- O2 F10第七天收集DC细胞：用细胞刮刀轻刮培养瓶底面，然后收集培养悬液至50ml离心管中，再用生理盐水洗涤培养瓶2遍，洗涤的液体与培养悬液一起收集混匀后取样计数，然后1500rpm（或400g）离心6分钟，上清留样冻存于-86℃冰箱备查，其余的丢弃。细胞沉淀根据所需回输的次数均分成若干份加入冻存保护液并做好标记后冻存于-86℃冰箱备用；) h5 I- {+ H& @; c
11DC细胞回输：
6 R# M8 U' o; |; M( P在CIK细胞可以回输时，与CIK细胞配合回输，按DC细胞与CIK细胞交替进行。每次DC细胞回输时取一支前面冻存的DC细胞，按细胞复苏的操作复苏细胞并洗涤。如果是肌肉注射，就用含2%人血白蛋白的生理盐水重悬成2ml并灌注到2ml的注射器中；如果是静脉滴注就用含2%人血白蛋白的生理盐水重悬成100ml。做好标记后交护理人员送病房回输。6 c, o: f9 }$ `4 T
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发表于 2015-10-15 09:49
