最近做了好多pcr克隆方面的实验，遇到好多奇葩结果

hyde

1，PCR产物克隆到平末端商业化载体上后，用质粒上的通用引物测序只找到上游引物，没看到下有引物（测序发现基因是全部克隆下来了，但酶切位点在引物上，引物序列不见了，切不了）。因为引物5端加了两个酶切位点，以及保护性碱基GCGC，不知道是不是影响特异性了。悲剧。2 L( }' _3 S7 R6 _4 \9 k, s
2，买了一个基因（在质粒上），想用PCR扩增出基因，但是PCR时Tm做了好几次梯度都没有出来。现在采用通用引物+基因上的引物来逐渐缩小范围，但是效果不是很好，通用引物的Tm和设计的引物差别优点大，可能要重新设计引物，真是纠结。
6 L( e. p% s# k0 h: Q" l, K3，使用质粒做模板PCR时，产物中间少了一段。（模板上的基因是测序正确的，但是用引物扩出来测序就发现不对了，是不是质粒的环状结构导致的？线性化质粒会不会好一点？）
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有没有什么建议呀？