诱导过程中挑选克隆的标准 与 iPSCs 的传代（有饲养层与无饲养层）

Andyhigh

最近在做重编程的相关工作，有几个问题一直困扰着我，想请教下！
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1. 自己在试验当中，发现克隆的同步性不是很好，大家是如何确定最佳时间的？刚开始自己是发现有一些克隆就挑选，剩下的继续放入培养箱继续培养，这样的结果往往是克隆摊开（应该是分化），甚至个别孔出现污染（细胞漂浮）；
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2. 大家是根据什么标准样挑选克隆的？先分享下自己的经验（第一，克隆致密；第二，克隆边缘清晰；第三，克隆未老化；第四，克隆呈现圆形 椭圆形等形状；重要性按照排名先后）额；即使是这样，发现自己的AP阳性率（AP阳性克隆数/克隆数）也不高（10%-20%），且能支持单细胞传代的就更少了，比例差距比较大，有些是挑选几个就出现1个阳性的，有些是挑选30几个才出现一个；效率太低；
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3. iPSCs 传代的问题，不知道大家用的是什么样的方法，是单细胞传代还是克隆传代？希望大家能回复下具体而详细的步骤！先提下自己的疑问：有多大比例的iPSCs 能支持单细胞传代，自己只了解06年 07年的iPSCs，单细胞传代能力还是一个不错的指标；
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4. 在病毒诱导出现克隆后，大家一般是怎么处理的？是手动的挑取克隆，还是用化学的方法进行消化传代····6 F* H% x- [- {8 V4 w1 U5 w$ {# N
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5. 无饲养层诱导和培养的iPSCs，大家是怎么进行传代的；最近，获得了一孔这样的iPSCs，本来打算扩大培养的，自己就用Tryple 消化的方法收集细胞，并吹打（30下）成单细胞悬液，以便均一的进行扩大培养，不过遗憾的是，细胞就这样无法形成单克隆了；自己推测的问题是，这样的iPSCs 无单细胞传代能力；自己查到了一篇文献，文献上说的比较模糊，只是说手动的挑选克隆进行传代！不知道大家用的是什么方法···
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补充内容 (2014-12-15 21:46):: L3 ^6 Y6 d9 N0 i
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! X" K0 [: w/ {! s3 ?补充内容 (2014-12-22 13:42):
* U) g  p8 r( o* t; L不知道大家怎么消化克隆样的细胞的（主要指那些致密的克隆），自己发现按常规的方法：1个克隆加入300ul tryple 轻轻吹打20-30下，感觉消化不下来（消化下来的细胞很少），也不知道是什么原因，基本排除试剂的原因

zhangweihwz

“发现克隆的同步性不是很好”，限定因子诱导重编程过程是随机性的，所以每个细胞的重编程进程不一致是正常的，不可能所有的细胞同一个时刻出现克隆。

Andyhigh

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0 F! L7 O. E$ c6 D5 e能帮助解答下其他几个问题嘛，发表点看法也可以哈！

zhd0506

回答你第四个问题，第一代手动挑取 形态饱满，边缘清晰并且圆形突起的克隆。

jojo1988509

唉，我最近也面临这个问题，我开始在饲养层上面挑那种在形态上面看起来很典型的细胞传代，我可不敢打成单细胞，但也没有长起来，有些形态像的不知道是分化了还是本来就不是只是形态像也会分化，不知道是手法还是什么问题，因为后面又发现饲养层支原体污染。& G" V8 M+ v* {
现在无饲养层的也出现克隆了，我正在纠结怎么办，你之前给有一些做过的经验什么的啊？我这次准备活染了去荧光下面挑去。

葱葱

可以发一张你初期克隆的照片吗？我也在养，可是挑克隆是我的痛。我用的是无饲养层，我不知道克隆是由于太密形成的，还是就是诱导而成。当然细胞确实长满了。

陈阳阳

我最近也在做啊，可以多交流。

Andyhigh

回复 葱葱 的帖子% Z0 v, b4 p% T4 B
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今天才看到回复，你们可以直接回复我的帖子!& u' H; \) `% ]4 B6 _$ ?

: h3 T1 k3 O6 ?; _; b. q你说的用无饲养层 是指全程无饲养层嘛（包括无饲养层诱导和培养iPSCs）

Andyhigh

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5 l9 Y- D1 Z6 Q: Z1 |/ e欢迎多交流！

Andyhigh

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9 q7 z/ z0 G! t也就多挑一些质量好的克隆了，能具体说下活染嘛？