石蜡切片之免疫荧光

yeshch

+ t$ B8 H6 t1 Q/ a( X7 T8 B% K1 l# e* M' K
请问那个前辈可以给小弟讲解一下免疫荧光的详细原理呀？尤其是加一抗、二抗的注意事项及操作细节技巧~兄弟多谢了！

moluxingke

这些其实有着和做western差不多的原理，首先都是利用一抗识别抗原，也就是你要检测的靶蛋白，然后用二抗结合一抗，起到一个信号放大的效果，因为二抗上带有荧光标记基团，在特定波长的激发光照射下，就发出特定波长的荧光。其中的注意事项，说多也很多，说不多也不多，主要就是保证组织不要放置太久，以免蛋白降解过度，另外抗体好用最重要，特别说明一下，如果做双标，那么一抗就用不同来源的，比如一个是兔抗，那么另外一个抗体就不要用兔抗了，以免二抗不能特异识别，并且二抗的荧光标记也不能一样。知道大致原理之后先试做一遍，就有个大致的概念了，反正很多细节问题都是在实践中发现的。祝你顺利

yeshch

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1 s: G( L5 [$ n+ ~" t
* K- O7 e  L, j2 g/ t( pOK，thanks！

jieniao1

我给你我做的一个protocol吧，一抗是不同源，还有前期根据抗体的要求做不同的处理就行了。
3 j0 s  r3 l$ TDouble immunofluorescence for CNPase and GFAP on fixed paraffin-embedded tissue sections.
3 g" G% }! s' o! D% m1.        Deparaffinization (2×3 min, Roticlear; 1×3 min, isopropanol; 1×3 min, 96% ethanol)." b* h4 s3 p1 g
2.        Incubate tissues in 0.5% H2O2 solution, 30 min, RT (inactivation of endogenous peroxidase).. C7 w) a( |$ U6 M8 r$ _: ^
3.        Rinse tissue with PBS, 1×5 min.- }% k; q1 N4 _: g
4.        Boil tissue in citrate buffer in microwave pretreatment, 20 min (antigen demasking).3 c/ q: T& o! F# H, v" K- `% H& y
5.        Rinse tissue with PBS, 3×3 min.
9 j) W: F1 r) v* f9 Y6.        Incubate tissue in 20% goat serum, 30 min, (blocking of unspecific antigens).: h$ n; `, a0 n- Y* o; B7 X6 ^
7.        Incubate tissue with both primary antibodies (CNPase, mouse, 1 : 100; GFAP, rabbit, 1 : 1000), 1 h.' w1 z' j! m; F# i- g1 J$ c' o
8.        Rinse tissue with PBS, 3×3 min.1 y8 n' P. v9 U7 Q
9.        Incubate tissue with both secondary antibodies (goat anti-rabbit Cy2, 1 : 200, goat anti-mouse Cy3, 1 : 200), 1 h, RT.
. [/ c, D, G% n' T6 v; j3 X5 f0 I10.        Rinse tissue with PBS, 3×3 min.
9 E! C1 ]$ P# d: U7 W7 g0 y11.        Incubate cells with bisbenzimide solution, 10 min, RT., _( A3 Q1 M6 g1 ^: g! r
12.        Rinse tissue with PBS, 3×3 min.
' J3 h: i4 G1 g3 e  D5 P0 y+ T13.        Rinse tissue with distilled water, 1×5 min.
& w) F0 Y# }: A2 [14.        Mount slide with Roti ®-Histokitt II mounting medium.& B9 y$ i. s6 h  x

yeshch

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, E3 J2 U! Z0 R) N! `& R& i
; ?3 c3 V) k7 w4 [( T0 h, Athanks a lot!i will make an attempt.

yeshch

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+ {. x* d; C  k切片的时候，切出来的蜡条褶皱很严重，而且经常展不开是怎么回事？还有就是材料很容易就跟周围的蜡分离，甚至材料在展片后总是有空洞。还望多指教!

moluxingke

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  J' t9 e% i% j& ~. K3 g! F4 I( k4 K+ r/ z, x& F$ q. Q4 u' ?
蜡片起皱一个原因是刀片钝化。建议及时更换新刀片，另外，有时候全新的刀片也会出现类似现象，这个时候需要将蜡块在冰上预冷一下，然后切片。时不时的用口对着蜡块哈气，这样切出来的片子就没有那么皱，展片时，在载玻片上滴加几滴70%酒精，然后将切好的切片放上去，再转到水槽里面，利用酒精张力，利于展片。展片水温可以适当提高一些。
8 q7 P) h# n% Y7 Z# X4 U! t  M关于第二个问题，主要是你包埋的时候组织过冷，和周围的蜡没有很好的融合，所以包埋要快，在没有包埋之前，组织最好浸在融化的石蜡里面。 意见仅供参考，也可能还有其他原因，逐个排除吧。

yeshch

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非常感谢你的指导，我再试试看