Nature：记录在血液里的肿瘤秘密(ZT)

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  W7 P4 x' G  N3 f1 M3 C; M( v血液里的循环DNA是可以指导抗癌治疗的，不过前提是科研人员们先研究出来如何才能够最好地利用这些分子。
4 t- T1 j7 j; i      2012年，Charles Swanton不得不直面肿瘤最“卑劣的”诡计。Swanton是英国伦敦癌症研究所（Cancer Research UK London Research Institute）的科研人员，他们团队对大量的肾癌样品进行了DNA测序研究工作，希望能够找到一些新的突变位点，但是单单在一个肿瘤里发现的遗传变异就让他们彻底惊呆了，他们没想到能够发现这么多的突变。在一个肿瘤组织里，一个部位的细胞就和另外一个位置上的细胞完全不一样，在同一个组织中，只有大约1/3的突变是所有肿瘤细胞共有的突变。患者身体里其他位置上的转移癌也与原发灶完全不同。+ H3 E$ D/ I) A3 N: [; z
       这一研究结果证明，过去被我们看作是肿瘤诊断金标准的组织活检（tissue biopsy）检查也是远远不够的，这就好像通过对一条街道的调查来推测整个国家的情况一样可笑。组织活检会漏掉很多信息，比如离活检部位几厘米之外的组织信息就无法检测到，但是这些信息可能就会决定患者的生死。虽然组织活检可以给我们提供一些肿瘤特异性的突变信息，根据这些信息也有可能找到效果比较好的抗癌治疗手段和措施，但是这些信息都只是“静态的”信息，不能够准确地反映整个肿瘤组织的全貌。% }, A- I, [0 y
       Swanton等人的研究成果更是让肿瘤遗传变异性变成了一道不可逾越的鸿沟。Swanton表示：“坦率的说，我们对此结果感到非常的沮丧，如果我们使用分辨率更高一些的检测方法，会发现肿瘤的遗传复杂性实际上更加超出我们的想象。”
; H+ J, f  \$ y  L       不过科研人员们也找到了一些办法，对患者体内的肿瘤有了更加丰富的了解，甚至能够对这些肿瘤跟踪一段时间。当肿瘤细胞死亡、裂解之后，它们会释放出细胞内的物质，其中就包括循环肿瘤DNA（circulating tumour DNA, ctDNA），即在人体血液循环系统中不断流动的肿瘤基因组片段DNA。正常细胞的碎片通常都会被巨噬细胞（macrophages）等“清道夫细胞（cleaning cell）”吞食、清理掉，但是肿瘤细胞往往都比较大，而且增殖迅速，所以清道夫细胞都难以将肿瘤细胞彻底吞食、消化掉。) S; n, h/ d. a; G6 B# s. A
       科研人员们经过不断的努力，开发出了能够对循环肿瘤DNA进行检测，并测序的新技术。这样就将一瓶瓶血样变成了液体活检标本（liquid biopsies），而且与传统的组织活检技术相比，这种液体活检能够更加全面地反映肿瘤的特征。而且在一段时间之后重复进行液体活检还可以了解抗癌治疗是否起效，或者肿瘤是否出现耐药性等多种信息。5 s( Z3 f; X# [' V+ B
       不过和以前一样，这种新技术也有其局限性。ctDNA的水平有非常大的个体差异，而且很难检测，在疾病初期，肿瘤体积还较小时尤其明显。另外，到目前为止，开展的相关研究基本上都只是选择了几个，或者几十个患者进行实验，而且关注的肿瘤类型也比较有限，只是那几种疾病而已。虽然这些实验的结果都很不错，但是还需要进行更大规模的研究，验证这种ctDNA检测方法是否能够真实地反映出最准确的肿瘤信息。更重要的一点是，还需要进行更大规模的研究来验证这种方法是否真的能够挽救癌症患者的生命，或者改善他们的生存质量。美国马里兰州约翰霍普金斯大学（Johns Hopkins University in Baltimore, Maryland）的肿瘤学家Luis Diaz就认为：“仅仅监测肿瘤还远远不够，我们现在面临的问题是找到这种技术最切实有效的应用途径。”
' z: ^4 Q5 X) M# R, ~- q+ a       美国约翰霍普金斯大学的遗传肿瘤学家Victor Velculescu也认为，如果科研人员能够全部解决以上这些问题，那么液体活检技术就可以帮助临床医生们选择更好的治疗方案，而且在治疗过程中及时做出调整。“而且这种新技术还可以帮助我们找到新的抗癌治疗靶点。让个性化医疗成为现实，这是一个彻底改变游戏规则的新技术。” Velculescu这样说道。
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# U% ^; ^: F8 [7 K2 V3 d迟来的行动
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- R2 S3 {  \" e% a3 r7 l6 |       早在1948年就有人报道过在人体的血液中存在循环DNA，到了1977年，又有人指出在肿瘤患者的血液中更加容易发现循环DNA。可是又花了17年，我们才发现这种携带了突变信息的循环DNA是肿瘤的标志，因为科学家们证明这些DNA的确来自体内的肿瘤细胞。
+ y& f( S, e7 A6 w8 Z. A       可是世界上第一个使用循环DNA的却不是肿瘤学家。中国香港中文大学（Chinese University of Hong Kong）的化学病理学家Dennis Lo第一个想到，既然肿瘤能够释放DNA入血，那么胎儿肯定也可以。1997年，Lo成功地证明一个孕妇的外周血液中含有来自她体内男性胎儿的Y染色体。这一发现让医生们能够在妊娠初期就可以鉴别出胎儿的性别，也可以不使用侵入式检查方式（invasive testing）查出胎儿是否患有唐氏综合症（Down’s syndrome）等发育疾病（developmental disorders）。这对整个产前诊断（prenatal diagnostics）领域都是一场革命。
$ n3 V. r2 [# \! u# z% E       英国剑桥癌症研究院（Cancer Research UK Cambridge Institute）的基因组学专家Nitzan Rosenfeld指出，不过肿瘤更难被‘抓住’。其中一部分原因就是因为和胎儿循环DNA相比，肿瘤循环DNA更难以被检测到。通常来说，血液里的循环肿瘤DNA更少，而且数量变异度非常大。对于极晚期癌症患者，肿瘤组织是他血液中循环DNA的主要来源，但是一般情况下，ctDNA只占整个循环DNA的1%，甚至只有0.01%。早期的基因测序技术是无法测定这么微量的DNA的，至少在测序的稳定性和可靠性方面还不足以让循环DNA成为一种生物标志物。2 E( r! F$ [* Q1 w' S8 _7 X
       近十年来，DNA测序技术有了飞速的发展，灵敏度得到了大幅提升，已经能够检测到痕量的DNA分子，并且对其进行定量分析。比如，借助BEAMing这种DNA扩增技术就可以检测到每1万个健康细胞DNA中的那一个ctDNA分子。这种BEAMing技术可以将循环DNA吸附到磁珠上，然后将其分离并进行检测。
0 b1 X  y$ b7 k9 U. v. m7 ]2 {       美国约翰霍普金斯大学的遗传肿瘤学家Bert Vogelstein和Kenneth Kinzler也开发出了一种新技术，他们在2007年发表论文，介绍了对18名正在接受治疗的肠癌患者的检测结果，他们使用这种新技术对这些患者体内的ctDNA进行了跟踪研究。结果发现，手术治疗之后，患者体内的ctDNA水平降低了99%，但是有些病人体内的ctDNA并没有完全消失。在第一次随诊时还是能够检测到体内ctDNA信号的患者中，除了1人之外，其他的所有人最后都出现了肿瘤复发的情况。不过在术后检测不到ctDNA的患者中则没有一例复发。" x" U. q1 l1 G! y/ t* |- `/ K
        这些结果表明，ctDNA能够告诉我们，手术治疗对患者的治疗效果如何，患者在术后是否需要接受化疗，杀死残余的肿瘤细胞等等信息。随后，科研人员们也对其它多种肿瘤患者进行了同样的研究，也得到了非常类似的结果。Rosenfeld与他在英国癌症研究院的同事James Brenton 和Carlos Caldas一起发现，ctDNA能够准确地揭示晚期卵巢癌和乳腺癌的特性。在一项迄今为止规模最大的科研项目中，Diaz和美国约翰霍普金斯大学的其他几名同事一起发现，在患有胰腺癌、膀胱癌、皮肤癌、胃癌、食道癌、肝癌和头颈部肿瘤等各种癌症的晚期患者人群中，至少有75%的患者能够检出ctDNA。不过脑癌（Brain cancers）是一个比较值得一提的例外，因为血脑屏障的原因，颅内肿瘤的DNA无法进入外周血液循环当中。
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更好的生物标志物/ g4 y6 U9 B6 x& P  |7 w. D8 M- O
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        数十年来，科研人员们一直都在寻找能够很好地反映肿瘤情况的生物标志物，与蛋白质类生物标志物相比，循环DNA的表现应该会更好。在临床工作中，蛋白质已经被用来诊断疾病，或者监测治疗效果。比如前列腺特异性抗原（prostate-specific antigen, PSA）就是前列腺癌的生物标志物。但是PSA检测会出现假阳性结果，因为也有其它原因会导致血液中的PSA增加。可是ctDNA检测出现假阳性结果的可能性就要低得多，因为我们不是检测ctDNA的水平，而是检测它是否携带有肿瘤特异性的突变，或其它基因组改变信息。另外，大部分蛋白质类生物标志物都可以在血液中存留数周的时间，但是ctDNA的半衰期却还不到2小时，所以能够更加明确地反映出肿瘤近期的信息，而不是很久以前的情况。英国剑桥和美国约翰霍普金斯大学的科研团队已经分别发现，在检测乳腺癌和肠癌方面，ctDNA要比蛋白质类生物标志物更加灵敏，而且在追踪肿瘤转归、转移和复发方面，ctDNA的准确度也更高。; |& E$ c) s) P; ^; t9 r: {6 u2 K/ o
       美国和英国的这两个科研团队还发现，ctDNA要比循环肿瘤细胞（circulating tumour cell）更加灵敏，所谓循环肿瘤细胞指的就是在血液循环系统中的完整肿瘤细胞，这也是一大研究热点。Diaz等人在一个16人的亚组研究工作中发现，当同时能够检出ctDNA和循环肿瘤细胞时，ctDNA的数量是循环肿瘤细胞的50倍。而且能够检出循环肿瘤细胞就一定可以检出ctDNA，但是有13个人却只能够检出ctDNA，而找不到循环肿瘤细胞。
/ x5 C* m4 ]$ {  `- y. }; @       不过Diaz认为，ctDNA检测最让科研人员们激动的还是它能够跟踪肿瘤的演变和转归，他说道：“该技术能够帮助我们回答很多在之前一直找不到答案的肿瘤学问题。”7 e: F! ~" d" @( {7 B4 b1 j' w9 x4 I* g, y5 X
        比如，为什么有那么多靶向治疗药物最终都是以失败告终？吉非替尼（Gefitinib）和帕尼单抗（panitumumab）就是著名的表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）抑制剂类靶向治疗药物，我们都知道EGFR是一种涉及细胞生长和分裂的蛋白质，在多种肿瘤细胞中都有过度活化的现象。患者使用这类药物治疗之后最开始都会获得非常明显的治疗效果，但是几个月之后就会出现耐药的情况，最常见的情况就是因为KRAS基因（该基因在多种肿瘤中都会出现突变）发生改变。
3 x7 Z+ T$ r$ J       在临床上，为了监测患者的病情，并且决定下一步的治疗方案，临床医生们往往需要进行多次组织活检。但是晚期癌症患者体内却经常有多个肿瘤组织需要活检，而且一个肿瘤组织的不同部位往往也会表现出不同的耐药特性。这种组织活检是一种侵入式的、有创的检查手段，操作上存在一定的风险，而且像肺脏等较脆弱的组织也很难进行组织活检检查。所以Velculescu认为，患者治疗失败之后，你不能够跟病人说，我们再做5次活检吧。但是采血进行液体活检可就简单多了。
2 ~1 V0 }0 K5 K" W0 j: w- g5 v; C       2012年，Diaz的课题组报道了他们使用ctDNA技术对接受EGFR抑制剂类药物治疗的肿瘤患者进行研究的结果。他们一共发现了42种不同的，与耐药相关的KRAS基因突变，平均来说，ctDNA技术能够比影像学检查提早5个月发现肿瘤的进展情况。Diaz他们重点观察的是KRAS基因突变，而Rosenfeld等人在用ctDNA技术寻找耐药突变时则没有预设的目标。去年，Rosenfeld的课题组介绍了他们对6名正在接受治疗的晚期乳腺癌、肺癌、或卵巢癌患者血样开展的全外显子组（即基因组中负责编码蛋白质的序列，在整个基因组中大约占到1%）测序研究工作。其中有5个病例都发现了耐药机制，比如有外显子发生突变，导致抗癌药不能与靶蛋白结合，所以出现耐药。
+ }7 C4 h: Y7 q( z: x1 q       尽早发现耐药情况可以帮助临床医生们避免给患者使用昂贵、有毒副作用，而且治疗效果也不好的药物。通过发现这些耐药突变，就可以找到其他的有效方案，或者制定出组合治疗方案。Velculescu说道：“我们有望将癌症这种致死性的疾病变成一种慢性疾病。我们可以选择一种抗癌药进行治疗，等这种药物失效之后，我们再换另外一种药。”
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临床应用上的限制, f+ ?4 J& K1 X% c* F
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       尽管ctDNA技术的前景非常光明，但是目前还不太适合应用于临床。因为目前最灵敏的ctDNA检测技术，比如BEAMing等技术依赖的都是已经非常明确的待测突变。但是这些突变信息还是只能通过组织活检的方法才能够获得。也就是说，我们只能先进行组织活检，对标本进行测序，发现突变位点信息之后，根据这些突变信息设计出特异性的探针，然后才能够进行ctDNA液体活检。每一个病人都得经历这一过程。不过也可以像Rosenfeld等人那样进行全外显子组测序。这就不需要预先知道突变信息，但是目前进行这种测序的成本非常高，还不太现实。
5 ?+ ?$ u) \5 b# Z4 G' b9 y! b6 V7 {# _       美国斯坦福大学（Stanford University in California）的肿瘤放疗专家Maximilian Diehn尝试过将这两种研究策略结合到一起。他们发现在肺癌患者的基因组中，有一小部分（只有0.004%）片段总是会出现突变。所以他们只要拿到一份新的肺癌患者血样，就会对这个片段进行检测——1万多次测序。这样就可以发现非常罕见的突变，而且检测成本会大大降低。    Diehn认为，因为差不多每一名肺癌患者基因组中的这个区域至少都会存在1种突变，所以这种方法适用于每一位肺癌患者。他们课题组现在正在对其他类型的肿瘤开展研究，希望找到类似的突变位点，并且进行临床实验，验证他们的发现，不过这还需要好几年的时间。
/ M6 F, ^9 M. }. {. n, s6 j       与其他的ctDNA活检技术一样，Diehn的这种方法对于早期肿瘤患者的检测效果也不太好。在一项小型研究中发现，这种技术对于2期及更晚期的患者具有100%的检出率，但是对于1期患者，检出率只有50%。这也很容易理解，因为晚期肿瘤释放的ctDNA更多，但是这的确限制了ctDNA检测技术在临床上的应用，使其还不能够成为一种癌症筛查手段。
% Z/ {. ~5 V9 C; ]7 o; T        Diehn认为，灵敏度更高的检测技术可以解决这个问题，不过Diaz却不赞成这个观点。Diaz说道：“限制因素是生物学本身。在循环血液中就没有足够的DNA片段。如果ctDNA检测提示我们，体内存在肿瘤，那又如何呢？因为即便在血液中检出了肿瘤突变，我们还是不知道原发灶在哪啊。”% `/ L8 m5 e3 K! p
       此外，还存在其他的不确定因素。比如ctDNA能够真实地反映出肿瘤的特性吗？肿瘤转移灶细胞也会释放出和原发灶一样多的ctDNA吗？肿瘤组织中的每一个肿瘤细胞是否都会释放出同样多的ctDNA？Diaz认为要找到这些问题的答案，唯一的方法就是进行“死亡后及时尸检（warm autopsies）”，在患者死后的第一时间将患者体内的肿瘤组织取出，进行分析，并且将分析结果与ctDNA检测结果进行比对。“这是我们接下来将要开展的重要工作。” Diaz说道。0 X7 ]- V4 m$ N' K
可是最大的问题还是没有解决，ctDNA检测能否准确地反映体内的肿瘤负荷（tumour burden），能否实时的再现新发的突变，真的能够挽救患者的生命，或者改善患者的生存质量？即便临床医生们发现患者体内的肿瘤出现了耐药突变，如果没有针对这种突变的药物，医生们也还是束手无策。所以Velculescu认为，最大的困难还是在靶向治疗药物方面。就算你掌握了所有信息，又能怎么办？我们对于肿瘤的研究手段已经远远地领先于临床医生们在实际工作中的需要，他们现在手头上可供选择的治疗方案还非常少。/ s' k- @2 Z2 y/ E1 U( U0 Y
       即便ctDNA检测目前还不能够改变癌症患者的预后，科学家们还是将这种技术看作是一个非常重要、非常有价值的科研手段。临床医生们也已经开始将收集ctDNA标本当作了一项临床常规操作。比如Swanton就正在领导一个投资1400万英镑，约合2400万美元，名为“在治疗中跟踪肿瘤演进（Tracking Cancer Evolution Through Therapy, TRACERx）”的肺癌研究项目。他们将使用传统的组织活检技术和每3个月一次的ctDNA检测技术开展研究。循环DNA有可能会（也可能不会）给我们提供有价值的线索，对患者进行研究。但是无论如何，至少可以让Swanton更清晰地了解和认识肺癌的演进过程，以及如何控制肿瘤的演进。
* z0 H9 N0 z: b# E6 Z: n       Rosenfeld也认为，有这种信息总比没有好。他最近表示：“我们正在黑暗中摸索。如果你有办法看到黑暗中正在发生什么，为什么不用呢？”' O" h$ @( H' J  f) j
原文检索：7 z; F. h+ d2 i; ]1 |, N1 ]
Ed Yong. Cancer biomarkers: Written in blood. Nature, 30 July 2014; doi:10.1038/511524a; , w  m/ I& w% F4 V
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来源：lifeomics 作者：EASON
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好文章，不转载可惜了。

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      曾记得有人说过：生命的秘密在血液里！这样的话。想想或细细琢磨一下，说的不是没有道理的。