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脐带间充质干细胞MSC培养
- W5 l0 `" D, k/ e1 T脐带运输：培养细胞时，脐带的来源已经成为生命科学中的一个重要环节。但是在运输过程中有很多途径都可能造成污染。比如：产妇自体顺产时有阴道炎症等疾病都能造成脐带的污染，另外在外科医生手术时手术室消毒不彻底手术台不清洁等也能造成污染。所以为了防止污染，在运输时容器里一定得加入抗生素。添加300U/ML青霉素，300μg/ML链霉素，150μg/ML庆大霉素和1μg/ML两性霉素。
& Z/ }0 Y2 b9 W2 p+ j脐带运输的容器：500ML广口瓶，一般孕妇体内脐带长值<49cm,>70cm.因为分离脐带要大于10cm才有意义，所以500ML的广口瓶比较合适。广口瓶里面加250ML培养基保持活性，或250ML生理盐水也行。同时加上抗生素。
% y2 E$ z! h: N脐带组织的分离：脐带 外被 是羊膜，内有一根静脉血管和俩根动脉血管，以及体蒂分化的粘液性结缔组织即华通氏胶。MSC细胞就是从结缔组织中分离出来的所以血管和羊膜尽量剔除掉。分离时把脐带放在生理盐水中剪成1平方厘米的组织块。组织块在生理盐水中一定要把血细胞涮洗干净，因为血细胞经过几小时细胞周期会死掉，死掉后的细胞碎片在培养皿里会产生大量的有害物质，影响原代细胞生长。所以一定要把血细胞尽量刷洗干净。把1平方厘米的组织块尽量剪碎。剪碎的组织块由于仅有少量处于周边的细胞可能生存和生长。若要获得大量生长良好的细胞，要把组织块尽量剪碎，组织块分散开，这样MSC细胞分离出来的才快。通常都是羊膜和血管剔除的干净，组织块剪得碎的爬出MSC细胞比较快点。所以剪组织块很重要关系到下面MSC生长状态。剪碎后的组织块移接到新的培养皿中加15ML的培养基。( P% w7 Y! ?9 s$ v" v7 Z
组织块生长和换液：组织块接种后1-3天，由于游离出的细胞很少，组织块在培养皿中粘贴不牢固，在观察和移动过程中要注意动作轻巧，尽量不要引起液体的震荡而产生对组织块的冲击力使其漂起。在原代培养的24小时内特别注意观察是否有污染，一旦发现细菌和霉菌污染要马上清除，以防培养箱其他细胞污染。在细胞培养时一般4-5天换次液，换液时半量换液。从培养皿中用吸管吸出8ML的培养基，尽量不要把组织块吸走。再加入8ML的新鲜培养基，再培养4-5天左右，再换液。然后再换液直到有细胞游离出来为止。原代细胞绝大多数并不是马上开始增殖，都得经历一段适应期或潜伏期。其时间长短不同，从几天到数周不等。MSC细胞是从原代组织块中游离出来的，因此早期会看到从组织块中分裂出的细胞，细胞最终会在培养皿中以成纤维细胞贴壁生长。成纤维细胞是最易生长的细胞，生长速度快，适应性强，细胞为细长梭形，多为放射状和漩涡状分布，有时互相连接成网状。& A. |" h! G( D$ L' y. b
原代细胞传代：原代细胞培养时一般15天左右就能长满整个平皿。细胞从组织块游离出后，经过悬浮，贴壁伸展进入潜伏期，然后开始生长进入对数生长期，细胞大量繁殖，互相成片最后长满整个瓶底。贴壁的细胞不要长的太少就开始传代，因为传代后细胞太少不适应新环境就会慢慢死掉。但是也不要长的太多，长的太多就可能营养物质缺乏代谢物质堆积，细胞进入平台期并衰退。这时细胞轮廓增强，细胞变得粗燥，细胞内出现颗粒堆积物。严重时就会从瓶壁脱落。所以在原代细胞长到80%传代最为合适。有的时候细胞早晨观察时长的不到一半，但是晚上就可能长到80%，这个时候晚上也得进行传代避免细胞明早长过，造成细胞大面积脱落，从而前期进行半个多月的准备工作将前功尽弃，昙花一现。
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发表于 2014-2-14 14:36
