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我爱火热的冬天

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优秀会员小小研究员

楼主

发表于 2013-11-29 00:06 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

我的载体上没有荧光标记和药物筛选，现在只有空载体包装的病毒和目的基因的病毒，我该如何进行下一步筛选，感染细胞后，如何检测外源基因的表达？

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沙发

发表于 2013-11-29 14:32 |只看该作者

那載體上總會有fused的tag吧，就好像HA，myc，那些，你可以用它們的抗體做western。如果你有目標protein的抗體，你還可以直接做。你可以轉染後收24，48，72和96小時的細胞來跑western,然後看看哪個時間的表達最高來做後續實驗。如果你只要筛选stably transfected的細胞，那就一定要antibiotic resistance gene了。

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懵懂干细胞

版主

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优秀版主帅哥研究员积极份子小小研究员金话筒

藤椅

发表于 2013-11-29 15:56 |只看该作者

回复我爱火热的冬天的帖子+ Y7 c! K+ N5 t9 {6 A5 `) u7 Z

看来楼主对自己的病毒感染率很有信心啊，我只能说如果你的感染率真的平时每次都能维持在85%以上的话，基本上后续检测就是确定一定外源基因的表达而已，如果没有的话，建议做个FACS检测，可以计算出比例的技术，如果你仅仅是RT或者WB检测的其实你只是检测出外源基因有没有表达，那怕感染效率20%甚至更低也有表达的。