引物设计是否正确

小兔子lp

8 w2 p0 |9 J+ q0 J8 n! q' _9 L6 [9 l
提取了RNA，反转后想扩增Pdx1基因，之后连接到病毒表达载体包装病毒。pdx1的CDS序列如下：5’-ATGAACAGTG……ACCCCGGTGA-3’。# N1 U- K0 s. i: h
上游引物直接设计为：5’-ATGAACAGTG]-3’
% h7 i1 N( g3 Z  u' i9 |1 ]下游引物直接设计为：5’-[TCACCGGGGT-3’(ACCCCGGTGA的反向互补序列): f; C: _( H+ S+ Q
请教各位，这样就可以了吗？这样设计就用不到PP5软件了呀！

murong

Tm值和加了酶切位点后的Loop Tm值都要用软件看下多少啊，上下游Tm值差异最好不要查过5度，loop Tm值最好不要超过40

小兔子lp

' B, ?1 F, ~6 a( M4 Y/ A' n
1 R: g- u) J0 t; e5 [回复 murong 的帖子
! t: V- y. W  l% `' ]- X; {& B& Q5 Q
验证引物是否可用是确实用了软件，可是在设计引物时就用不到软件了呀~我将CDS区复制进PP5,软件设计出的引物和我手动设计的这个也不一样啊，这是怎么回事呢？望指教

biovictor

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$ o0 _$ a3 g/ n" k# @( I9 ?
- L4 Y# s& ]* \/ i  y; c( o5 v" A/ s妹子呀！设计引物重点不是看你能否将设计的引物正好配对上去，重点是要看如下几点：
+ G9 G$ i! J( G. I（1）希望将自己的PCR产物连入载体中，是不是要解决酶切位点的问题。如果不用软件，随便弄两个酶试一下，万一他们的识别位点在你的基因序列之内，怎么办？那不就切烂了吗！
+ ]9 N: T, s! _3 n1 Y（2）不用软解分析，假如使用的酶在序列中没有酶切位点（走大运了！），但是保护碱基添加的数量或者酶切位点序列的添加不对，造成移码突变，等你连到慢病毒载体上，就是不表达蛋白，那就洗洗睡吧！
( n6 F3 N- @- w（3）万一自己的实验需要某种标签，来指示自己蛋白的成功表达，可惜妹子没有在意基因序列之后标签蛋白的感受，自己弄一个就可以了，如果造成后面蛋白移码突变，标记就在也不想理你了！所以要学会使用它呀！可以多问问你的师兄师姐。