人羊膜上皮细胞的分离、原代及传代培养

单个核细胞

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1.人羊膜上皮细胞原代接种后，在未添加任何细胞因子的培养条件下，生长缓慢，如果添加细胞因子的话可以添加哪种因子及其适宜浓度？2 g  n% v8 Z1 K$ H# r

! E4 u* z9 [; V! e2.在培养过程中（原代及传代），尤其是传代培养后，如何抑制间充质样细胞的优势生长？
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贴上几张人羊膜上皮细胞照片供大家品评：
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（1）原代培养阶段：原代接种第6、7、8天的照片，原代分离得到的细胞还是蛮多的
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2013-9-11 14:17 上传

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（2）传代培养阶段：传代接种第第3、4、5天的照片，间充质样细胞优势生长
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2013-9-11 14:17 上传

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% c' r1 q  V0 K$ T' ^( Y( c' Y: a（3）传代培养阶段：传代接种第第6、7、8天的照片，间充质样细胞优势生长
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2013-9-11 14:17 上传

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坤明

ruofan1982

看图片，你们原代分离的羊膜上皮细胞纯度还是蛮高的，可否分享一下你们的分离方法。0 _% L( J% t7 y% d
# Z* j/ ^" i) j: s  S; ?
羊膜上皮细胞培养比较困难，生长缓慢，一般传代三代后基本就不生长了。我们平时培养添加了EGF，但是效果也不是很明显，有更好的方法吗？

单个核细胞

3 N# [9 l+ k0 S4 H6 }% }" E0 s% [% s
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回复 ruofan1982 的帖子" F' x+ K+ x3 R: c+ h1 e
, Y" G; T- K- V& H
我现在也在摸索制备方法，这次贴的图片是用三种不同的酶组合消化后接种的，分别是胰蛋白酶、胰蛋白酶+Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶+Ⅳ型胶原酶，让我惊讶的是三种酶组合消化分离原代接种后长出来的情况差不多，我再重复试验时却达不到这个效果。现在正在改进试验方法，可以互通有无， 。

ruofan1982

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  h# p/ e, W* b3 {7 a6 T  r你是直接用混合陪消化的吗？还是分步消化？

coffee.cat105

单个核细胞 发表于 2013-9-11 15:06
) ]' @: f! b$ _回复 ruofan1982 的帖子
- k# Y2 T6 |6 ~4 k, {5 s( H+ j
; C. ^, i9 Z  @, i. j; A2 j2 F0 t" t我现在也在摸索制备方法，这次贴的图片是用三种不同的酶组合消化后接种的，分别 ...

& u2 s' d; {0 v7 `) c  S你们用胶原酶消化下来也是这个效果吗？我们用胶原酶消化下来都是间充质，先用胶原酶后用胰酶的效果也是间充质居多，只有只用胰酶的稍稍好些，但是也没有你这个纯，请问一下你用的多少浓度的胰酶，多少浓度的胶原酶，我们用的0.025的胰酶和0.01的胶原酶的

单个核细胞

回复 ruofan1982 的帖子' Q' _5 V3 u0 u4 [# h) [9 z/ J, n

5 y( m/ X# O2 w% h; G上面照片的这个是直接混合消化的，没有分步消化，后来我做的分步消化，其结果几乎都是得到间充质样细胞。我个人觉得上面照片的这份样本可能是一个偶然情况，因为后来我重复试验不可行。

wf78365421

回复 单个核细胞 的帖子) X& p3 D# A0 e2 X! c( Z8 n( Y
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是上皮细胞还是间充质细胞需要鉴定，不能光看形态。

单个核细胞

回复 wf78365421 的帖子
' a  h! D- j; ^; W6 H) E, |8 J- [. }. |+ `( V+ }. q  Q/ l
你提醒的是，，我现在只是初步分离实验，只能先通过形态观察，后面条件允许的话我会鉴定的。

一转身的距离

羊膜从结构上来讲，最外面是羊膜上皮，然后是一层无细胞的基底层，然后是含间充质细胞层，请问楼主消化前是不是已经把羊膜与绒毛膜分离了？然后消化完之后是不是已经把基底膜都消化掉了？你认为的这种间充质细胞是羊膜间充质还是绒毛膜间充质？如果单纯用胰蛋白酶消化的话，理论上是不会进入基底层里面的。个人觉得你的第一张图看上皮细胞还是比较纯的。不过没有鉴定就不好说纯度的问题。另外，也有文献报道羊膜上皮细胞在体外培养的过程中，会有EMT现象的发生，所以个人觉得你传代后出现间充质样形态细胞的来源也不好说。羊膜上皮细胞因为没有端粒酶活性，不能无限增殖，我所看见的资料培养体系中都添加了10ng/ml的EGF。