挑取克隆后，用胰酶无法将克隆消化饼分散

syacr

        如题，克隆出来了，用10ul的移液器挑去克隆到96孔板上，用20ul 0.25%胰酶消化15min，加180ul ES培养基终止消化。发现克隆根本没有消化开，用移液器吹打不下100下，还是无法吹散，求各位大神帮下忙，是消化的时间不够？胰酶浓度不对？非常着急，就好像快饿死的人看见了面包，却拿不到，唉。。。

Jonathan

胰酶的使用，是必须用PBS先洗一次的。如果没有，效果会很差。然后更糟糕的情况是，15min时间太长了，细胞被消化死了，你所看见的没有消化开，只是细胞死后粘在一起的团块，里面是没有细胞形态的。自己在镜下看看吧

细胞-77

”用10ul的移液器挑去克隆到96孔板上，“你是ES建系还是做电转呢？有可能你挑的时候吸进了培养液稀释了胰酶的浓度等

uslzhang

请注意一个细节，用胰酶消化细胞需要加EDTA，不知道楼主有没有加EDTA。

syacr

回复 Jonathan 的帖子$ l' W) z( ?$ G) W! ^

+ t" S, j& E, j) I% {3 k! o感谢回复，确实就用PBS就洗了一次；至于消化时间我是按照山中伸弥protocol做的，我也觉的时间长，平时消化都没有这么长时间

syacr

回复 细胞-77 的帖子: I, Z; c, q) m" t5 M6 m
+ m8 }0 _# ^. S, [/ G
是建立iPS细胞系，出了克隆一直消化不好

syacr

回复 uslzhang 的帖子2 U8 i/ y7 r+ \: J) Y
& V, }8 S: C0 ~% o9 N2 V
嗯，这个注意了，胰酶中是加好EDTA的

nydfy

建议用gibco的accutase试试，消化1-2分钟后用枪头吹打，效果还可以，不过很大的克隆也不好消化。

syacr

回复 nydfy 的帖子6 l, F; K6 R" S

, ?2 [0 y# S$ g; E: f7 ]& G& Y嗯，好的，试试，谢谢您的建议

小兔子lp

0.25% trypsin-EDTA 会不会太猛了一些？用胶原酶 Iv 试试~