请教关于Oct4-GFP MEFs问题

damaoshu

想知道Oct4-GFP MEFs 背景.有人说是Oct4 启动子和GFP基因融合在一起,可是我在网上看到的是GFP基因在Ot4第5个外显子的下游.请教它的遗传背景. 还有,GFP是如何被调控表达的. 是内源的Oct4 调控还是外源的Oct4调控的?
  D- e7 ?  o/ YYamanaka四因子（OKSM）都参与细胞重编程的过程,为什么用Oct4 的表达就能代表着重编程细胞集落的形成,其他的三个因子不能代表吗?
% v% e+ k2 t6 I% L: K% _% f最后一个让我很纠结的问题：在重编程的过程中，到底是外源的四因子起作用还是内源的四因子？在iPSC形成过程中，外源的四因子和内源的到底什么关系？! m' L. U$ U0 Y1 V% k) A1 O* ?/ o
谢谢专家的指教。% b8 d* c4 n. [# k# k  s2 ?

chutu

照你说的，好像是Jax的Oct4-GFP小鼠。这种小鼠的Oct4基因终止密码子之后敲入了IRES-GFP的编码序列。IRES序列的作用是形成多顺反子，即一条mRNA编码多个蛋白，上游的蛋白翻译完成之后，IRES序列可以使它下游的编码基因继续被翻译出来。这样一来，当细胞内Oct4表达时，就会有GFP跟着表达，visualize了Oct4的表达，起到iPS细胞产生的reporter作用。对于你的问题，可以这样讲，Yamanaka四因子（OKSM）导入细胞，可以启动细胞内的多潜能基因调控网络，其中Oct4也是多潜能基因的重要一员，内源性Oct4的表达标志着细胞向iPS状态的转变。外源因子完成使命后就应该“沉默”，否则影响iPS的稳定。

w343989328

按理来说应该是OCT4 promoter drive的，knockin的位点在染色体上，所以和外源性没什么关系吧。至于它的准确位置信息，去查一下老鼠的出处，或者做个PCR southern来证明吧。重编程过程中，首先起作用的当然是外源性的基因，转进去的基因通过一系列复杂的过程，改变细胞的表观遗传方式，从而使细胞获得多能性，标志性的就是内源性的OCT4开始表达。楼主不妨想一下，要是GFP是外源性OCT驱动的，那转了之后数个小时就会表达了，重编程的过程何需那么久？关于从外源性的表达到内源性的启动，正是重编程的机制，已经有很多文章报道这一过程并给出自己的模型，楼主可以找找

damaoshu

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3 w* i$ a+ ?; {( D2 b: E; R, Z
, P0 H, v& ?* ]9 \3 V& }: W谢谢你的回答．) i9 L. M3 w1 ~5 @- X
ＯＳＫＭ四因子今人体细胞（ＭＥＦ）后，启动多潜能基因网络，改变染色体结构，使基因处于开放状态，这样这些重编程因子就可以就可以和基因调控元件结合，促使多潜能基因的表达。外源因子完成使命后是如何沉默的？

damaoshu

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# h8 Q0 S3 s& o" r; ?谢谢你的回答。
% A( d$ _- R- [* R+ C既然是内源Oct4驱动ＧＦＰ的表达，那么它是如何驱动的呢？7 x1 H; b/ s7 b, X
Oct４是自己可以驱动自己的表达也可以驱动其他的三个因子的表达的。" |9 E* S7 f+ ~7 j; G5 U
如果外援不能直接驱动内援的表达，那么外援就是驱动别的转录因子表达或者改变Oct4基因所在染色体结构然后促使Ｏｃｔ转录的因子结合在它的启动子上，内援的Ｏｃｔ连同ＧＦＰ报告基因表达了。这种状态也是iPSC成熟的状态了.是这种可能吗？
" m, k8 G  a6 q7 L2 [- c3 W关于重编程机制我没有看到一个明确的说到外援和内援关系的。

damaoshu

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1 j  U: L6 ]( T; G- T8 v谢谢你的回答．( l4 P& E" C- Y+ Z4 D$ E, E7 t+ Y
ＯＳＫＭ四因子今人体细胞（ＭＥＦ）后，启动多潜能基因网络，改变染色体结构，使基因处于开放状态，这样这些重编程因子就可以就可以和基因调控元件结合，促使多潜能基因的表达。外源因子完成使命后是如何沉默的？

chutu

早期做iPS用的是逆转录病毒载体将OSKM导入细胞，其启动子容易自发沉默，可能是被甲基化修饰的结果。

w343989328

回复 damaoshu 的帖子; M, ~/ [" J" x6 Y
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因为GFP是连在内源OCT4启动子下游嘛~那内源性OCT4表达的同时GFP也就表达了。至于这里的内源性和外源性OCT4，并不是简单的一对一的关系，内源性OCT4的表达是几个因子共同的结果，中间涉及的过程叫重编程。这一过程持续好多天，其终点是细胞获得多能性，这一多能性的标志就是内源性OCT4的表达，如果是OCT4-GFP的话，就直观体现在GFP表达。
; i9 k$ a! ^" y3 t- y  P" X- x你如果要探讨从外源到内源的过程，可以找一下一些文章。