定量PCR反应过程中Rox™染料如何使用

runsong

本人做定量PCR从没用过ROX，后来看到ROX可以均一化校正由于移液误差或蒸发所导致的批内体积差异及均一化校正批间体积差异，提供更连续一致的批间重复Ct值。我不太明白ROX怎么用，是直接加进去吗？还有机器是如何用ROX的荧光校正的。是不是将各个反应体系得到的荧光（如SYBR Green ）值除以其ROX的荧光值？

weiyepan

4 e: ?' q) q9 G3 Z& D! U9 n9 n: q( f- e, b
不是的，一般来说仪器会有自己calabration的程序，用的染料标准品一般是仪器厂家自己出的calabration的kit，当然也可以用外面大厂家配的kit。每一种荧光对应特定的波长，每一个波长段理论上都是需要做calabration的。原因是不同的仪器对每个孔的读数都会有差异，因此需要一个标准品来平衡每个孔之间的差值。& L$ L; o  b) P7 Y6 p* g
如果楼主只是用的SYBR Green，就没必要做的Rox，那个只是一个附加的平衡值，因为你读数的波长不是Rox的波长。当然，有一些机器做了会好一点，或许那个机器的发射光也会有差异，所以最好还是根据你自己机器的说明去做calabration，不要盲目看试剂厂家或者其它地方的介绍。