求助！EB不贴壁！

ligangtiancai

如题，我在EB诱导过程中遇到几个问题：我用1*10*5/ML的密度将iPS细胞悬浮在低粘附的6孔板中，可形成的EB周边不够圆滑，感觉像是有很多的死细胞，而且悬浮5天后转移到铺明胶的板中后几乎没有贴壁的EB。查了一下大家说可能是iPS状态和EB质量的问题，可是我的iPS状态一直都不错，呈边缘透亮的卵圆形，可形成的EB边界总是感觉不够清晰，死细胞很多（悬浮和悬滴都试过，都是一样），不知是什么原因？谢谢！

zmm

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) o% N5 M# y. @6 \3 L; D
$ A2 ~1 A# K% Z$ \9 K) @% aips本身状态不错的话，那时不是培养EB时的液体有问题？还有就是做EB时消化时间是否太长了？

ligangtiancai

回复 zmm 的帖子2 a  V4 w+ v5 `0 s$ O7 W; W+ N

6 H4 T) }$ ~$ W5 S1 V" J7 |' ?1 w培养基是高糖dmdm+20%FBS+1%NEAA+1% L-Glu  都是PAA的，之前用过10%和15%的FBS，结果也类似。iPS消化约2分钟，不知是不是消化的问题，但同一瓶中的细胞传代后生长良好

zmm

回复 ligangtiancai 的帖子$ `8 z$ o& e  `& w+ L- f
+ {1 ?  D( V' a
你这个培养基有问题吧？不加lif？培养基的成分还是挺重要的。你培养EB时可尝试用一下国产皿或者玻璃皿。

ligangtiancai

回复 zmm 的帖子' o( P3 r0 Q3 P3 j8 @! U) Y: [

6 @% K/ W7 g. ^) M* Q9 x  A' w我这个是诱导分化时的培养基。培养EB我用的是corning的低粘附板，主要是在悬浮5天后需要贴壁培养时EB不贴壁

zmm

回复 ligangtiancai 的帖子5 {+ x/ u  ]) K! \" S3 k1 L. o5 f$ {
* Y  u8 C# j4 V1 R0 u; W/ @
那你铺明胶了吗?

ligangtiancai

0.1%明胶包被30分钟

frankieisme

你可以把0.1%明胶包被时间延长到过夜or24h.还有EB接种好后最好前24h内不要动培养皿.我觉得最主要的原因可能是你EB的质量不太好的原因. 悬浮培养的时候最好每天换液,随着EB的生长,可以看到培养液变黄的程度越来越明显.

ligangtiancai

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: _' [. G" j/ x1 N  M( ]5 Z2 n$ m0 B7 C* y% h
恩，我觉得你说的挺对。应该还是EB本身的质量不太好。不过我的iPS一直状态还有不错，难道问题出再EB的制作上，能告诉我一下你制作EB的详细过程么？

也行天下

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# F5 a$ e; M  F4 r  J. ^5 z: j4 ]8 b. Q$ w) i0 k4 B5 I
我们最近用AggreWell培养板做的EB，很漂亮，在后面的培养中，贴壁也很好。