关于构建microRNA过表达质粒的问题

iamxuchen

最近想构建microRNA的过表达质粒，转入ES细胞看效果，各位请问用什么质粒载体较好？带GFP的还是pCDNA3.1好？我可能做好几个，直接把前体序列PCR出来插入就可以了吧？

iamxuchen

还有一个问题就是克隆出的pri-mir片段需要加上ATG的序列吗

chenzhongyan

哪位大侠赐教一下。我也打算做。现在一无所知

weiyepan

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7 Y- N2 S& e3 T% M' x! f" b
8 y) \' @# |. @5 L$ i/ V  z/ Y不用ATG的，你需要哪种miRNA，如果是人的话好多公司都有全套的，例如复能基因，你可以打个电话去问一下，那里好像自己也有载体，带GFP的也有。

xiphias

请看2004年一篇science 的文章。0 p; D9 Q; ^1 M3 x# i  o, _* M  q0 a
MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation
1 X- ?7 a' S; c" J3 b0 Q# J+ b$ Q9 t/ q" G
只克隆前体序列是不会表达miR的。8 w; T8 h$ T- B% }) t2 g3 _
不需要ATG。
& H' L  ?  V7 t& P8 h个人觉得有GFP，或者抗性会好点。

xiphias

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9 K$ S$ [0 a2 Q& {
' {* }' s: X/ A* ?5 h3 a3 d microRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation..pdf (1.27 MB)

2012-4-13 17:41 上传

请用IE浏览器下载
miR表达
下载积分: 威望 -2 , 包包 -5

9 e2 ~. b. [+ U: U" o2 s

3 E/ Y* N, p4 C* {0 t( cAll constructs with at least 40 nt on each side of the 67-nt hairpin were efficiently processed into1 ]' c# R0 q+ y; X' i$ {; O
the mature miRNA (Fig. 3B)

jkfly

我自己做用的pCDNA3.1，并且成功了。另一个没做过。

iamxuchen

jkfly 发表于 2012-4-13 18:19
4 ]  b. {) F1 S" b) H- J6 d' I0 |我自己做用的pCDNA3.1，并且成功了。另一个没做过。

9 ?* {  Q6 s( d( n9 N追问下，我自己做的pcDNA3.1过表达感觉效率不是很高（293里面），也就8倍多点，听别人说用T7启动子的会好很多？

茅草无敌

我也想问问就是构建pEGFP载体到底需不需要将atg放进去啊？

86964109

miRNA构建是不是U6或H1效率高啊