qPCR大家关心的是神马？

xiao6tao

我最新作qPCR很郁闷，ct值忽高忽低，而且总是10倍稀释的时候ct值得差别大于3.3甚至小于3.3.1 }: D) Z8 Z) H' ^- o
我有几个疑惑。; G! i5 s1 S) ]
相对定量与CT值有关，那么扩增的荧光值最低到多少才算合适。我的荧光平台才到0.4
- e! y+ \7 n5 ]% i5 o' F都说rna在-20度不能保存过久，我的已经已经在-20°一个多月了，还能用吗？
: B: S9 }9 y* q8 d+ e, F关于溶解曲线，那个峰我的也是很低的，峰才到1.67 P& C- y2 S! [  d, h% ~
求各位高手帮忙

goodboy

回复 xiao6tao 的帖子! o. f# ^7 G# a9 X

  I1 Q; m* U0 [1 t8 kRNA在-20度确实容易降解，建议你放在-80度或直接重新提取，要不然你跑个琼脂糖电泳看看能否跑出三条带，不行的话只能重新提取。置于Qpcr，我之前将模板梯度稀释ct值变化也不是很一致，这可能与加样有关，建议你配好mix后分装不要一个一个的添加

xiao6tao

回复 goodboy 的帖子4 O. G  j: P, R3 N. a9 P& d* @+ X

% y% U: q3 }" F恩，谢谢！但是我想知道你们的荧光值一般到几啊 我的是不是太低了，才到0.5左右。溶解曲线峰值才到0.26

sirius_zou

1.qPRC我关心的是重复性和灵敏度，复管之间CT值差异关系到SD 值，也关系到实验的精确度。灵敏度的话主要是通过标准曲线体现出来。
! P8 E; w! ^8 X2.理论上待测样本10倍稀释后CT值相差3.3，但实际不是绝对的，只有尽量接近3.3，高于3.3说明样本或反应体系里有PCR抑制剂，比如RNA提取时酚氯仿是否去除干净，低于3.3说明扩增效率高于100%，可能是整个体系原因，也可能是引物非特异性扩增。$ G- K' I) t# g2 p/ `  W' Y  g5 T
3.关于样本：RNA在-20度下是很难保存的，LZ可以跑琼脂糖电泳看看条带，如果是两步法qPCR最好将RNA及时反转录。
( |. C( C% f& U* X4.关于荧光值低的问题，我以前也遇到过这个问题，用不同公司的试剂荧光值差异很大，还有就是方法的影响，LZ用的是probe还是SYBR？LZ的荧光值才0.5确实太低了，基本可以忽略不计，应该不是mix的原因，可能还是RNA降解了。重提RNA试试。