流式抗体荧光淬灭现象疑惑

gact

做了流式发现应该阳性的却没有发光，无信号；9 g+ ?9 Y' j9 ]7 [4 S8 \
固定后放在冰箱过夜，大约10h后上机，影响荧光信号么？4 [+ h0 E1 g: u+ I
染料为APC、percp710；
0 f, d6 _$ `: q! ^而PE却能正常是阳性；
3 a' O2 H2 [: K. F! q9 ?/ `  ~请教原因，，
2 r# X, |" f7 \$ r7 v- ]谢谢！

jhu132llh

冰箱过夜是4度还是-20度6 u7 ~. j$ U+ F& P) R
要是-20度得话有可能出现阁下的情况

ljzmy82

最好染色之后马上上机，这样结果好些

luozhen1018

原因有很多：抗体是否有效？抗体有效的前提下，就是你操作的问题了。比如抗体加入量，孵育时间，洗液的使用等等。孵育好抗体后，最好尽快检测。我个人觉得，固定后检测效果不是很好。

wangzhiqi86

楼主就这么肯定是荧光淬灭了？会不会有其他的什么原因。流式标记完后，4℃冰箱可以放几天，我经常是隔两三天才去测的，之前也是测不出来，后来发现是操作的一些关键地方没注意

Tonypan

楼主确定标记的抗原表达嘛？多高？

leisong12

回复 wangzhiqi86 的帖子0 e, X% q  J9 Y( M5 Y2 F9 _

. g9 K2 [5 V( y, G7 l& j哪些关键的地方，能否具体谈谈，多谢分享

wangzhiqi86

回复 leisong12 的帖子% R% o7 S. I9 `# m0 o
2 G$ G" F: N+ o* h  v
由于标记加入的抗体很少，所以每次抗体稀释液洗涤之后，要留少量液体，再加入抗体，充分混合，4℃避光时，要隔一段时间就去敲打一下，因为细胞多，液体少，细胞过几分钟就会沉淀下来，敲打可以让它混合的更均匀，接触更好

kgx1986

回复 wangzhiqi86 的帖子4 y1 P9 |8 }8 d

: h( V( i: ~, E) B) w# t& a# {- n请问抗体稀释液是指管内需要加抗体的细胞悬液吗？一般情况下你4℃避光孵育多长时间？隔多长时间敲打一下呢？

wangzhiqi86

回复 kgx1986 的帖子1 `) P  U1 m4 j+ k2 Y" F

8 B3 M( K, y0 ^! F1 Z* T抗体稀释液：0.1% 叠氮钠，1% BSA溶于1×PBS（pH7.0），是稀释抗体作用的，4℃避光半小时，每隔10min敲打一下