用于基因治疗的锌指核酸酶发生不可预期的错误

towersimper

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用于基因治疗的锌指核酸酶发生不可预期的错误

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技术证实高度特异性的分子工具犯下的错误

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【towersimper注：本文为译文，有部分改动，仅用作研究之用，不得用作商业开发，转载请标明翻译者towersimper，原文来自Heidi Ledford, Nature News, "Gene-therapy enzymes make unpredicted errors", August 7, 2011; Doi:10.1038/news.2011.461】
. y& E% B6 \! {! d! v2 r在基因组特定位点进行修改的分子工具，对于遗传研究和基因治疗而言大有希望。但是对这些称作锌指核酸酶(zinc-finger nucleases, ZFNs)的工具的作用位置进行第一次全基因组调查已经让研究人员吃惊。
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2011年8月7日，两篇论文发表了，一篇在Nature Biotechnology杂志[1]上，另一篇在Nature Methods杂志[2]上，都证实尽管ZFNs是高度特异性的，但是这些以前被用来预测它们可能在哪儿出错的方法都没有达到目标(失效)。7 d1 o/ \6 ?: M' L) ~3 C

( G* N; p5 O' a8 K$ A+ IZFNs能够被设计为找到基因组中特异性DNA序列并对它们进行切割从而剔除这些序列或者用一个基因交换另一个基因。利用ZFNs删除一个允许HIV侵入免疫细胞的基因的临床测试也正在HIV病人当中开展。
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: n5 k& j0 o9 R% E- h3 b相对于采用病毒在基因组上几乎随意地插入基因的常规基因治疗，这些酶应当是一次巨大的改进。这种不可预知性已经导致问题发生：在首批基因治疗临床测试的2003年一次试验当中，S. Hacein-Bey-Abina et al.等研究人员通过逆转录病毒介导的γc基因转入自体CD34骨髓细胞的方式来治疗一种罕见免疫疾病，即X连锁重症联合免疫缺陷(X-linked severe combined immunodeficiency, SCID-X1)，也称作γ链(γ chain, γc)缺陷。5名患有SCID-X1的小孩经病毒介导的基因治疗后发展为白血病，这是因为病毒载体将它自己嵌入在致癌性基因LMO2启动子附近[3]，导致LMO2的异常转录和表达，激发成熟T细胞(携带γδ+或αβ+ T细胞受体)不受控制的指数型克隆样增殖(exponential clonal proliferation)。
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虽然ZFNs特异性非常好，但是它们仍然有可能导致不想要的变化。加州大学戴维斯分校的一名分子生物学者David Segal说，“我们需要知道它们是否确实达到我们认为它们将到达的地方”，“没有人想ZFN在细胞中发生可能导致致癌性突变的故障”。
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大海捞针(Needles in haystacks)
( K1 N. u8 J# e德国海德尔堡癌症研究中心的一名肿瘤学者Christof von Kalle是追踪早期那次试验产生白血病原因的研究小组成员之一。他决定寻找ZFNs所犯的错误。: L, U( M! ?* A9 J1 D- v

! y* T- ^# e6 X: m( ]& o- {人们很难找到这些酶的罕见性错误，因为它们能够潜藏在受治疗影响的上千个细胞中的任何一个里面，因而对每个治疗过的细胞的基因组进行拖网式筛查以便找到DNA裂口是不现实的。% S( f" [+ @7 l0 u& r2 m% T6 J
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在过去，研究人员已经通过检测ZFNs在何处结合基因组随后核实这些序列是否断裂的方式来找到这些酶所犯的错误。/ b% ?% T* \% O. \6 `

* e8 e. Y/ B* k, ~+ mVon Kalle和他的同事们采取一种不同的方法，让治疗过的细胞接触一种将自己插入宿主基因组断裂处的病毒[1]。他们然后在细胞中寻找病毒基因来发现ZFNs在哪些序列位点发挥作用。在测试的那些酶中间，有两种酶类似于正在临床试验中采用的ZFNs。) v9 y$ l1 E% H5 s) ]' ?

7 j) ~8 ~) E6 i' {8 R他们在常规方法不能预知的序列位点上发现脱靶的裂口。
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来自盐湖城犹他大学的一名生化学者Dana Carroll(为参与这些研究)说，对该领域而言，这是一堂重要的课程。他说，“它提升一种认识高度”，“它表明当你考虑在细胞中实际产生的DNA裂口时，你会发现你不曾预测的事情”。5 T' B! M6 _2 [' b9 v

. C* V/ c9 a8 I' M脱靶(Off target)
, j+ Z) D7 [, c. L' e/ c来自马萨诸塞州剑桥街哈佛大学的一名化学生物学者David Liu开发一种不同的方法来搜寻不想要的DNA裂口[2]。他的研究小组首先在体外对一个大的DNA片段文库进行筛选以便找到那些被两种ZFNs中任何一种切割的片段。研究人员随后在人类基因组中寻找类似的序列，并且测试这些序列在培养的人类细胞中是否会被切割。2 j9 Z  q* T  {2 X* S
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Liu发现这些酶要比曾经预想的情形更广泛地切割DNA序列。Liu和他的同事们测试的这些酶当中的一种酶类似于当前正在HIV临床试验中采用的一种酶。研究小组发现，在罕见的情形下，这种酶在与癌症相关联的一个基因附近的DNA序列上产生裂口。Segal说，要确定这是否对病人构成危险是困难的，因为Liu的研究小组是在白血病细胞培养物上进行测试，然而临床试验药物作用于一种免疫细胞类型，即T细胞。; c8 f" t/ U, n6 |  h, ?' `% z

) c5 G; i1 k* n+ F  R; tSangamo生物科技公司(Sangamo Biosciences) 位于加州里士满市，制造了这种HIV临床试验药物。它的科技总监Philip Gregory也提到，自从Liu和Kalle的研究成果发表以来，该公司制造的ZFN为了在临床上使用一直在作进一步优化。0 ^0 @0 Z) A% w' c  ]- l3 j5 z' R( B

8 Z& v& c& J/ G6 v1 Q5 z2 Q' N( `在开展临床试验之前，Sangamo生物科技公司已经通过移植十亿多个基因修饰过的细胞到150多个动物体内然后寻找不想要的副作用的方式来测试该酶的安全性。
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Gregory认为，Kalle的方法是与Sangamo生物科技公司一起开发的，可能用于未来筛选临床候选药物。但是他相信美国食品与药物管理局(FDA)的监管者们不可能放弃在活动物上进行安全测试的要求。他说，“高档的分子技术激不起FDA的热情”，“他们喜欢守旧的和‘向我展现修饰过的细胞并将它们打入动物体内’式的方法”。) ]6 C- Z. A& U
, w: C' n8 D) w8 s# p) S. v
参考文献：
) P6 X$ m- A* \* O* ]8 Z! R1 e3 URichard Gabriel et al., "An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity", Nature Biotechnology (2011) doi:10.1038/nbt.1948 | Published online 07 August 2011, http://dx.doi.org/10.1038/nbt.1948.
% |5 z( x; O  B' z( e$ ~8 m- b8 R
" p6 p$ T1 v) V/ \7 u3 OVikram Pattanayak, Cherie L Ramirez, J Keith Joung & David R Liu, "Revealing off-target cleavage specificities of zinc-finger nucleases by in vitro selection", Nature Methods (2011) doi:10.1038/nmeth.1670 | Published online 07 August 2011,
9 ^8 {2 E4 |  j& x+ chttp://dx.doi.org/10.1038/nmeth.1670.
+ J. w" p6 I, c3 V3 k! o
' J7 h' e: R# h# B- FS. Hacein-Bey-Abina et al., "LMO2-Associated Clonal T Cell Proliferation in Two Patients after Gene Therapy for SCID-X1", Science (Oct. 17, 2003): Vol. 302 no. 5644 pp. 415-419, DOI: 10.1126/science.1088547, http://www.sciencemag.org/content/302/5644/415.

towersimper

回复 towersimper 的帖子5 Z* I# e+ i2 h$ L5 {
9 p8 L- S2 G% V+ R5 g. i" y( c5 K& n
之前，帖子“两种精准修复人类干细胞点突变的基因编辑技术：ZFN和TALEN”，来自http://www.stemcell8.cn/thread-44649-1-1.html，这个帖子为ZFNs技术的不足之处，会发生低概率脱靶效应，即在错误DNA位点发生切割。

towersimper

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/ |1 u. i/ ^& i" Q
7 _' N) X! V1 V& M* u1 f可以看出这两篇研究论文对Sangamo生物科技公司的影响，该公司拥有这方面的专利，而且正在用ZFNs进行HIV临床试验。FDA是对的，就应该严格一些，难道该公司想直接跳过动物实验，直接在人身上测试啊？

fwyou

如果需要，这两篇文献我下载了 看了看。。。。做的很新。。。哈哈
$ Q2 k- z1 n/ F) i- t+ G
9 }  z( ]% s4 @* t% X4 ^$ K需要文献的联系我。。。

fguw

脱靶，是zfn和其他人工核酸酶最大的问题，所以我们老板很反对，不过，是新的东西，做研究还是可以的，$ k/ w  b3 [) f% n3 T! K  `  E
Sangamo公司的ccr5  zfn可以上临床，很重要的原因是HIV感染，目前没好的法子治疗该疾病

towersimper

回复 fwyou 的帖子/ S; s. _; Z% @% w8 A2 M
7 h' _& Z; d) e" D9 d/ l
好啊，有原文啊。上传一下，大家分享一下啊，

hyde

回复 fwyou 的帖子: [  O5 V/ g$ A( |9 f

9 t* m) t! ~6 L, _4 Yhyde628@163.com" X" q8 l  r& e( k
谢谢

fwyou

好吧！传上来大家一起看看吧，有问题集体讨论，集思广益吧

towersimper

回复 fwyou 的帖子
( d( m/ t# ^; [4 X! b. H/ L! a  h
谢谢，已经下载，好好看看先啊。

四梦学子

谢谢楼主，好好看看！