miRNA模拟物的转染体系与步骤

runsong

希望讲得尽量详细，包括所用试剂、体系成分、操作步骤及转染效率。, n+ k; @: M; ~0 x, W1 a) e
我用的是上海吉玛公司的，不带荧光。

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8 f0 t+ L2 V5 _9 e0 _
# A( @4 H  {3 l: B" E1 U$ }: k" L大家看能不能参照这个. b3 R8 J( F/ W5 O1 n, |- i
siRNA 的转染（24 孔板为例） 4 a4 X, K& j3 F% l! F1 R; |
I．准备细胞： " x0 L- V0 o% E  t. @) @4 @
贴壁细胞：转染前 24 hrs，在 500 uL 无抗培养基中接种 0.5 - 2×105个细胞，转染时细胞融合度为 30 - 50 %。 (注：铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞堆生长。)  7 l8 _3 R: l: x4 E3 Z4 i0 O% Y
悬浮细胞：转染前 24 hrs，在 500 uL 无抗培养基中接种 0.5 - 2×105个细胞，转时细胞数量应在 4 - 8×105/孔。
. W$ ^" Q1 E6 A- Z( G
5 H$ G- \- p( v5 @9 ~3 l; ~II．对于每个转染样品，按下面的方法准备：
' g6 y  s" I  p" i$ W  用 50uL Opti-MEM 稀释 siRNA (转染细胞的终浓度为 33 nM)  ，轻轻吹吸3 - 5 次混匀。
; Z5 b; n  N  T  轻轻颠倒混匀转染试剂，用 50uL Opti-MEM 稀释 1.0 uL Lipofectamine TM 2000，轻轻吹吸 3 - 5 次混匀，室温下静置 5 min。 - e3 p4 F' I) ~0 K4 x8 F" @
  混合转染试剂和siRNA稀释液， 轻轻吹吸3 - 5次混匀， 室温下静置20 min。  , k3 D+ a( n  A4 v
  转染复合物加入到 24 孔细胞板中，100 uL/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。  ) u, \' j% j) V5 }* N( g
  细胞板置于37度、5% CO2 培养箱中培养 18 - 48 hrs。转染 4 - 6 hrs 后可换新鲜培养基。

runsong

自己顶。

rain2402

你的步骤是基本可以的，但是转染的试剂和siRNA的浓度比例，却要自己摸索，因为每种细胞可能都不会一样，你可以按照转染试剂的使用说明来操作。

做个好孩子

这是用RFECT转染方法，本说明书适用于24孔培养板的转染实验，其他规格的培养板的用量参照下面表格，表格给出的是每孔的用量与体积。
' |' u, p3 G  N: [# @3 l  Z0 MA. 细胞接种：转染前一天接种细胞，每孔 500 μl 培养基（不可加抗生素），使细胞在转染时密度在30-50% 。- s8 q$ k) F1 g* H( G) i1 Y
B. siRNA-RFect混合物准备：
2 C) S. e: E8 e& F1. 6pmol siRNA 用50μl无血清培养基稀释。9 u% L4 L7 V' u2 \
2. 2μl RFect用50μl无血清培养基稀释。轻轻混匀，室温孵育5min。注意：确保在25 min内执行第三步操作，不要过于延迟。
5 g1 d4 {/ l1 ~3. 孵育5min后，将siRNA 稀释液与RFect 稀释液混合（总体积100μl）。轻轻混匀，室温孵育20 min。& z) F* O  x" D( P
C. 将混合物加到培养的细胞内（完全培养基培养）：; v5 A& I8 o1 F/ F  u1 h% P( X# i
1. 将100μl混合物加入培养孔内，培养孔内含有0.5ml培养的细胞。轻轻晃动培养板，混匀。7 E" Z4 |+ W) j$ W0 F% k
2. 37°C培养18-72h，检测基因抑制效果。如果需要，细胞培养4-6h时可以更换培养基，但不是必须。孵育时间的长短，取决于细胞类型、
3 X0 v, }) L5 x# }所干扰基因本身及分析方法。可设置不同的孵育时间进行实验以确定最佳孵育时间。

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十年了