PCR中最佳退火温度

pla269

回复 moluxingke 的帖子
" h1 m8 e( F, |& G
7 a4 I! O. P# x2 G7 p( l. c& F你怎么设梯度啊，几个引物一起做啊？

luoziwei

我一般是比合成单建议的Tm稍微高3~5度左右，

like_gj

一般引物设计时都都会有个Tm值，很多教程上都是说用较小那个Tm值减5
0 T% ~, h6 l& V/ N; y# S2 z但是也未必，有的由于退火温度过低会增加杂带或是由于酶的扩增效率过低，产生很弱的目的条带) [3 m" t8 O2 h( A6 Q
所以建议先用Tm值试一下，一般都会有特异性产物，如果较弱或有杂带可适当提高温度

amosummer

实践最重要，多摸索几次就可以了。当然最先还是以说明上的退火温度试试，可以前后调整，找出最适温度。

461650833

做个梯度PCR 摸索一下最佳退火温度

chliu

4 Q$ q+ L5 r3 p5 g2 }, r- C, `

3 W" v/ X/ S% @' h+ \& ~8 |1 C根据软件给出的温度，先试一下，不行就做温度梯度PCR，检测最合适的退火温度。一般只有一条特意的最亮的条带所用的温度便是最合适的

rain2402

一般都会用Tm值减5度作为退火温度，但是有时我直接用Tm值做退火温度效果会比Tm值减5度效果好，这没有一个固定的最佳退火温度，是需要根据不同的PCR扩增来摸索的。

vivian303

究竟应该怎么选择呢，同lz问

pla269

回复 langziforever 的帖子
4 N( I# W- e6 ^3 B' c' f
/ @7 `- b3 J9 o你摸最佳退火温度一般以几度为梯度啊

langziforever

回复 pla269 的帖子2 v5 c1 m0 a4 P  g. g8 o: m
0 o+ K0 Y# h2 l; f$ U
不知道你们的PCR仪可以设温度梯度嘛？如果可以就按照55到65来设吧！如果要单独一次次的做，那你需要保证其他的条件是一致的，比如体系完全混匀，加入引物的量等等！最好是在一个PCR上面做！