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【材料及准备】
, Y$ r7 l' A, P$ p, t/ x1.一般的盖玻片，或专用爬片；3 q6 D5 d- C% ~2 g
2.根据需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；
" b: [; }6 g; _3 f7 {% o3.将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍，放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。
5 W) p% z3 G8 o2 ]2 U l; y4.高压后取出放入烤箱中烤干，备用。烤干后可放入超净台中。4 L, B7 _0 k. c
5.关于多聚赖氨酸，很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。: T; z" i4 F. v& j! x5 l1 ]
6.常用的固定液
8 b; h; C( S; y! t4 R8 b6.1丙酮 可用于一般的免疫组化染色。. H8 l# Q! b3 L5 x3 K) }; `
将纯的丙酮预先放入冰箱-20℃后便为冷丙酮（放心，丙酮在此温度不会为固体的）细胞爬片取出后，PBS洗2遍，便可加入冷丙酮于-20℃（丙酮有很强的挥发性，注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严，防止其挥发）固定10分钟。取出后，室温吹干，然后放入-20℃保存。% S: Y" G. P# X5 x. e1 a( B
6 M6 ~6 z; C; U+ Q6.2 多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光以及TUNEL染色。 : D/ ^+ y5 [0 F5 t- v( ?' n$ c
主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等
; {( {- \, ?5 ]- t室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存
]/ p5 i8 T: g$ L- `7 Z }
$ G2 X/ F! L M4 o0 }6.3 95％乙醇，可用于免疫组化。
, M' R0 q! a0 ^优点：穿透性强、抗原性保存较好。
( j% S8 r0 U9 J! [0 W缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度
6 ~# V' D/ B% \- ]室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存+ h, B4 [. T$ n+ q2 z: G, \- A
6 W% J( S' I: A' O* e, }6.4 甲醛(福尔马林)应用最广 . b9 ~$ K4 n$ u! Y; |: ~" U
优点：形态结构保存好，且穿透性强，1 K( G: @0 C8 e" a. f& Z' W
缺点： 甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色； 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。$ _% Y+ k8 X5 Y9 r
& O% i" N1 J6 E3 y【细胞爬片步骤】
# _' ]- I: H2 V. e- a- G1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。9 x) e( P, r5 f6 i
2.加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。整个过程注意无菌操作。
/ r R. ?; q: [; } f( c+ v& A3.根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可
N8 A4 X9 ]3 H/ b9 }. x2 K' [4.待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。7 d' {$ o- z' w; o* V
5.按照实验设计，作用一定时间后取玻片。取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。如果要做诸如24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。末取出的可接着继续培养。( U, [" D7 Q# M$ l. u; s
: J3 n* M9 K+ q+ Q( b【细胞爬片的固定】
' u, ^9 B1 J D% X$ R* V细胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。当然，根据研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗，因为凋亡的细胞在洗的过程中有可能会脱落。
) Y2 t" Q# q1 E9 t# l7 d另外在保存细胞爬片的时候，一般用培养皿或板，先在皿底放一层面巾纸，然后再放爬片，这样方便做实验时取片。然后盖上盖子，并在盖子上做标记，为避免混淆，可用透明胶带将盖子和皿连在一起。一般-20℃保存2-3个月的片子做免疫组化是没有问题的。
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发表于 2011-6-23 22:26
