又翻了一篇Nature Protocol （关于ips诱导的整个过程）

huangcong1988

/ G  D, {) o* a* V/ o4 ^
' I9 d0 @# }) ?1 N/ j8 L在此省略实验试剂和仪器设备步骤
7 n  d- F; A7 E+ T3 h, q成纤维细胞的制备+ Y& v% o1 e& _: x9 u
1.        从鼠胚胎（A，MEF）或者鼠尾尖(B,TTF)获得成纤维细胞。一般情况下，胚胎成纤维细胞能得到更多ips colonies  x1 E  P, Q+ Q4 k) k1 o
A 时间：15d
% o; D4 [  @; z（1）        通过断颈杀死怀孕13.5d的雌鼠，分离子宫并用PBS作简单清洗。
" C# w4 [, E  h5 G2 N（2）        用镊子将胚胎从胎盘和周围被膜组织中分离开来，将胚胎的头部，内脏组织和生殖腺去除/ i) v" ^6 a* R9 o/ a
（3）        将胚胎移至装有fresh PBS的100-mm dish中清洗，用剪刀将剩余体躯剪碎，移至装有0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)的50-ml conical tube，37°孵育20min
: |' v" s1 a+ U' V6 T7 _（4）        另加0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)，37°孵育20min
8 b- A2 d' D' Y7 u1 R（5）        加等量的FP medium (6 ml per embryo)，反复吹打使组织充分分开
( F  M! X/ n. `! a! Y8 x3 E- J- z（6）        Keep the tissue/medium mixture still for 5 min at room temperature (20–25 °) 以去除杂质，将上清移至另一新的50-ml conical tube。200g离心5min，弃上清，使沉淀重新悬浮于新的介质中。
! {9 f/ m% p% z2 v  Z（7）        细胞计数，在FP medium中调整为1 ×106 cells per ml。通常，一个胚胎能获得约1×107个细胞。将细胞悬浮液移至 100-mm 组织培养皿 (1 ×107 cells per dish)， 37 °5% CO2 下孵育 24 h (passage 1)4 T+ e0 {* I  a* q) M
（8）        第二天，用PBS清洗以移除漂浮的细胞。5 u+ h( a1 _0 j9 C3 t
（9）        当细胞充分汇合时，去掉FP培养基，用PBS清洗一次，用1 ml of 0.05% trypsin and
5 u# n5 {! ^$ m" E/ K8 |0.53 mM EDTA 消化 5 min。脱落之后，加9 ml of FP medium并吹打使之悬浮。移至新的100-ml皿并作1:4的稀释(passage 2)。三代以内的MEFs作为ips的细胞来源，避免衰老。* J/ d7 n' P8 t7 T6 }3 O2 ~" }5 G
- \+ b. O/ ]. r. U7 y9 a
尾尖（B）时间：10d6 p6 W# i* k% r/ [
在此略6 ~5 b5 {1 m8 m# f" q. h) }
解冻 SNL cells  TIMING  0.5 h3 |5 w+ v5 L  x( |6 j* ^4 R
（1）        准备9ml的SNL medium于15ml的tube中
. R0 F2 E- a! k9 \9 |' y（2）        从液氮罐中取一小瓶冻SNL cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）) V# E: ?+ P" }4 w1 M6 a! i5 M3 b
（3）        用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）
( S2 S0 Z. H8 T2 K4 e0 y（4）        160g 离心5 min，弃上清
# [$ F' y1 g/ E# ]( u（5）        用10 ml of SNL medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm皿。37°，5% CO21 V2 T6 F1 S5 T6 m
孵育，直到达到80–90%汇合6 X" a6 M3 c, t. N4 F! q0 ]
- X! ~& u0 v1 w1 d# _* j, K
CRITICAL STEP  不要让细胞过度汇合，否则会影响它们作为feeder的效果。2 K/ A: W. T0 `0 I- V1 D' l: Z
$ C3 W- S- }8 S' s0 `
SNL cells的传代 time：0.5h
3 n0 F; Z! m: Q' }: v（1）        弃培养液，用PBS清洗细胞一次! r- h3 [- s: d. _
（2）        吸出PBS，加入0.5 ml per dish of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，室温下孵育1min" J. g  @& P) Z! z4 s- Y5 \6 P
（3）        加4.5 ml 的 SNL medium，吹打数次使细胞成为单层细胞5 \& B# l8 ?1 ]! d7 D  R2 W
（4）        通过加入SNL medium调整细胞悬浮液为160ml，移至gelatin-coated dishes (10 ml per 10-cm dish)。This splits the cells 1:16。37 °, 5% CO2孵育直至细胞80–90%汇合。This should happen 3–4 d after passage
/ K4 d3 _$ M* ?2 Q* ^: b& X- {. E4 M& s: G
Mitomycin C-inactivation of SNL cells  TIMING  3 h
3 k& c+ t! l$ N( v( P（1）        直接加0.3ml  0.4 mg ml–1 mitomycin C solution 到the culture medium of SNL dish，swirl it briefly（短暂地），37 °, 5% CO2孵育2.25 h。The final concentration of mitomycin C will be 12 微g ml–1
) F4 Z' P% {0 O（2）        孵育后，吸出所有的mitomycin C-containing medium，用10ml的PBS清洗细胞两次。3 c0 y  g* x1 j7 m
（3）        吸出PBS，加0.5 ml of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，摇晃使cover the entire surface，然后室温下静置1min
) U- @( \3 y2 `0 B（4）        加5ml SNL medium中和trypsin，反复吹打使细胞成为单层。Pool the cell suspension into a 50-ml tube ，细胞计数。Seed the cells on gelatin-coated dishes (1 × 106 cells per 100-mm tissue culture dish, or 1.5 ×105 cells per well of 6-well plate)1 E# B  c/ W! c. R$ L
（5）        细胞之间不应该有太大间隙。They should become ready for usage by the next day.3 Y: x- j) `, v8 R  W0 p
PAUSE POINT% M6 C7 J0 D$ X- H! F5 j) `! O
The mitomycin C-treated SNL dishes 在用之前 can be left for 最多一周
3 }6 k- G3 z' k% R1 q& i+ H
# ]" K0 c( I& I. @/ r+ [* i' k解冻 Plat-E cells  TIMING 0.5 h（与解冻 SNL cells操作基本一样）# u# K6 s5 s* M
（1）        准备9ml的FP medium于15ml的tube中2 R( E+ @* Z0 U- F( D2 w
（2）        从液氮罐中取一小瓶冻Plat-E cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）1 _6 E) Y4 `2 \. f
（3）        用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）
" e8 z+ E) {( W. O: u（4）        160g 离心5 min，弃上清! x- E+ L  t7 t, _
（5）        用10 ml of FP medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm 皿。37°5% CO2孵育
9 ^) C7 K% `5 s7 `（6）        第二天，用新的培养基（添加了1 微g ml–1的puromycin和10 微g ml–1 的blastcidin S）替换原来的培养基。继续37 °, 5% CO2 孵育直至它们 80–90% 汇合. t9 {0 d( G* {( n0 z

, q  v5 w) c: V5 f* @7 T0 g  |( TPlat-E cells传代  TIMING  0.5h
- Q; u" t$ F6 Y* O（1）        吸出PBS，加入4 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min。轻拍，使细胞从培养皿上分离下来，用10 ml FP medium使细胞重新悬浮，转移至15ml tube中。180g离心5min，吸出上清  `- p* A" V0 H$ @2 X- x. J; K
（2）        加入适当体积的FP medium，反复吹打，使细胞成为单层，Seed them to new 100-ml dishes at 1:4–1:6 dilution。细胞应该在2-3天内汇合' A' h; y- P+ c# q% A6 u6 D7 C7 `) j: T
Day 1: retrovirus production; Plat-E preparation   TIMING 1 h1 m' b6 b* G1 K4 q
（1）        用PBS清洗细胞，加入4 ml 的0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min! l6 D4 u, ~; |
（2）        之后，加 10 ml FP medium 到 the Plat-E dish，轻轻吹打使细胞悬浮，将细胞悬浮液移至50ml tube。FP culture medium used in this period contains neither puromycin nor blasticidin S9 V  q9 C0 t2 {1 U8 O( b
（3）        180g离心5min  C, c5 i% c) t6 M
（4）        弃上清，用手指轻拍以打散沉淀细胞，用适量的FP medium 使细胞重新悬浮2 K) Q" V- K$ @# U' A& {# k
（5）        细胞计数，用FP medium将细胞浓度调整为8 ×105 cells per ml9 A1 ]7 k/ q) o9 \1 k1 p9 X$ E
（6）        Seed cells at 8 ×106 cells (10 ml) per 100-mm culture dish, and 孵育过夜at 37 °, 5% CO2
2 d% L3 Q7 {# xDay 2: retrovirus production; transfection into Plat-E cells   TIMING 1 h
2 i! Y* j* k. b( L. B9 x9 A（1）        移 0.3 ml DMEM into a 1.5-ml tube8 b4 F& H% w% w) G
（2）        在（1）中的tube 中加入27微升的Fugene 6 transfection reagent，用手指轻拍混匀，室温下孵育5min
" ~: e/ s9 w9 R1 o: X7 H: k（3）        加入9 微克 of pMXs plasmid DNA (encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc)到Fugene 6/DMEM-containing tube（drop-by-drop），用手指轻拍混匀，孵育15min
3 x- B+ {# _. L（4）        逐滴将DNA/Fugene 6 complex 加到 Plat-E dish中，37 °, 5% CO2孵育过夜
8 Z) S: ]7 f% X* W: |* g0 [' b; U9 ^1 R7 H- Y
关键步骤( U0 H/ q" Q& W$ N
Also transfect with a suitable control；we use pMXs retroviral vector GFP to monitor transfection efficiency。We routinely obtain efficiency ＞80%. High-efficient transfection is crucial for iPS cell induction
, g# n, q+ o% E- U7 e2 h! u5 r; h) ~
Day 3: retrovirus production (continued)   TIMING 0.5 h; l- e9 |3 L8 V  v+ D2 z' ?$ b
吸出transfection reagent–containing medium，加入10ml新的FP培养基，return the cells to the incubator# w( @" e! t* ]6 U% W
Preparation of fibroblasts  TIMING 1 h
- C/ m) _- P( P0 L% z4 v$ D: R6 B（1）        培养MEF或TTF（passage＜ 3)至约90%汇合in 10-cm dishes（约2×106 cells per dish）5 S$ K5 m+ F" I
（2）        吸出培养基，用10ml的PBS清洗! y+ S# F7 ]& l8 |) p, |
（3）        弃PBS，加1 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，37°孵育10min# _& u! O$ }) E
（4）        加9ml培养基，使细胞悬浮且为单层，移至50ml tube中
. f* f0 }) [, M# h( X（5）        细胞计数，调整细胞浓度为8×104 cells per ml。移10ml细胞悬浮液至有mitomycin C-inactivated SNL cells的100-mm dish (use puromycin-resistant feeder cells for NanogGFP-IRES-Puro)。37 °, 5% CO2孵育过夜。) m9 B* K2 n( H
Day 4: retroviral infection   TIMING 0.5 h* U4 e* L/ i/ ~5 j
（1）        用灭过的10-ml一次性注射器收集 medium from the Plat-E dish，通过 0.45-mm孔径大小的醋酸纤维素过滤器过滤,后移至15ml tube 。
  G; L% U  c( B! O7 m（2）        加5 微升的 8 mg ml–1 polybrene solution 到 the 10-ml filtrated virus-containing medium，轻轻的反复吹打使之混匀，The final concentration of polybrene will be 4微g ml–1) `. X0 o% g# X
（3）        Make a mixture of equal parts of the medium containing Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- and c-Myc-retroviruses." c: h& v0 p4 O8 K
关键步骤1 \2 j; \$ K* C) q, c9 u
Retroviruses should be used freshly.不要冷冻，否则您将不会获得ips细胞。Retrovirus滴度对于ips细胞产生相当重要，The freeze/thaw step 降低病毒滴度; m8 B0 C' p* L5 K+ |* n
3 @% i4 G6 l! S7 s0 n
（4）        从fibroblast dish中吸出medium，加入10 ml of the polybrene/virus-containing medium。37 °, 5% CO2孵育4h或者过夜
4 F/ O( y2 ^) _0 ^6 ?$ B9 p& J7 N, n
Day 5 and 6  TIMING  5 min each day5 l* ~5 i7 l& N3 d7 _( c- _( p
24或者48h之后，从fibroblast dish中吸出 medium，加入10ml新鲜PBS
$ ?: n+ O5 N2 s( ZDay 7   TIMING  5 min% j# S1 A6 m- q7 W
弃培养基，加入10 ml ES medium，For Fbx15βgeo/βgeo selection, the medium should be supplemented with 0.3 mg ml–1 of G418  }  |. o; |- g
Day 8–10   TIMING 5 min each day6 M# M8 f7 [3 R) Z2 `/ B
每天更换培养基（分别在24,48,72h后）
- X3 M' h5 s' }Day 11   TIMING 5 min3 F% O2 @. \( W4 \' q- W
For NanogGFP-IRES-Puro selection, add puromycin to the medium at the final concentration of 1.5 mg ml–1
& @: W) Y6 {& \: kDay 12   TIMING 约5 min each day; c4 [- `% {6 f7 q) M8 N
每天换液，直至colony  becomes big enough to be picked up. Colonies should first become visible approximately 病毒转染1周后. They should become large enough to be picked up around day 20（TROUBLESHOOTING 1）
9 b+ D8 r8 K# I1 ]9 TCounting the colonies: 结晶紫染色   TIMING 1 d' {$ s! _5 Y) Z: c- z  K
（1）        colonies收集后，完全吸出PBS，加入5ml甲醇固定剩余细胞，室温下孵育1min
2 C$ o7 k; E* X. E（2）        Wash the dishes twice with water.7 K4 t- ^, @6 R2 X3 i+ H
（3）        加 5 ml 0.1% 结晶紫溶液到皿中，室温下孵育5min
5 E6 l' `# v4 C$ Q9 B# L（4）        Wash the dishes with water
5 _- m9 I5 N& j  O1 A2 [  V* c（5）        Photograph the dishes and count the number of colonies.
! W( ~2 N* `6 ^  Q2 l. \. b/ T8 x6 `/ p4 Z6 `1 X3 r0 ~
Expansion of iPS cells  TIMING 1 h1 i( y" I" v2 z8 G4 |5 E+ ?
（1）        弃培养基，用1ml PBS清洗细胞
/ f1 A1 U  \! O（2）        彻底remove PBS，加 0.1 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min9 @4 K0 |0 P' d4 `
（3）        加0.4 ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层9 g! Q2 r5 ~" J2 T( ~3 \8 O: j" o7 C
（4）        将细胞悬浮液移至 a well of 6-well plate，加1.5 ml ES medium，37 °, 5% CO2孵育直至达到80–90%汇合in 6-well plates。At this point, prepare frozen stock of the cells, as follows（TROUBLESHOOTING 2）. v6 F3 B0 \6 T# B5 _; d* c! G
Preparation of freeze stock   TIMING 1 h
6 T- |% d% L3 F+ O2 J（1）        弃培养基，用2ml PBS清洗
) {) y- j$ ^) H0 W  q9 X1 l（2）        彻底remove PBS,加入0.3 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min
! m4 w* b7 P  G2 Q（3）        加2ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层2 U1 [) V+ {2 c% `2 O2 O8 R
（4）        将细胞悬浮液移至15ml tube，细胞计数，160g离心5min+ q! V# N) u. I: [
（5）        弃上清，用ES重新悬浮细胞至2×106 cells per ml
. Y5 ~; G+ G5 P8 b1 G/ K8 @" e（6）        Prepare 2×freezing medium (20% DMSO in ES medium) and 小份分装（每小瓶0.5 ml）
6 Z7 i+ {; O5 h& R9 K& L（7）        加0.5ml细胞悬浮液到freeze vials（冻存小瓶）中，轻轻混匀; E& y  ~1 W7 }& C* [& z& ~
（8）        Put the vials in a cell-freezing container and keep it at –80 °overnight （TROUBLESHOOTING 3）
& w% n% A! x& o: S! L! VPAUSE POINT
& |3 ]" w: [7 _6 u  JFor long-term storage, keep frozen cells in the gas phase of a liquid nitrogen tank.4 V( }1 J7 m5 r  H; j- l

sunny2829

什么时候的呀？？
& O2 Z3 l) v$ ]6 f8 o( x

huangcong1988

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0 R* Y8 ^* ]5 W" }& T! N& k+ @
  e& e( y0 H( X. B9 g2 ^- O这个有点老咯，07年的，不过很经典，其实现在做方法都差不多，只是在原来的基础上改进

前途似锦

0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)  太多了吧  我10来个胚胎就加1-2ml  

huangcong1988

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/ e- y# r6 y* I
- ~/ W% `$ _/ k5 _) m  R! p  V呵呵，这个是07年Nature Procotol上的，直接翻的，所以可能实际操作时量可以酌情调整，呵呵，而且小鼠胚胎大小也不是固定的，酶活性也不定，所以有时候可以适当增减，是吧？

midautumn

我是新人，想要学习iPS细胞的培养。有些问题想要请教一下。& E9 k6 c( z4 K& {$ i
这里提到了三个细胞系，MEF是用于诱导iPS的吗？那Plat-E cells 转染慢病毒又是为了什么的？另外SNL细胞作饲养层细胞，是不是也能用MEF作饲养层细胞呢？
; _8 f6 P$ j2 Z4 Q. M3 ^5 b* I新人求教，问题可能小白的点，烦请各位帮忙解答一下吧！

midautumn

我是新人，想要学习iPS细胞的培养。有些问题想要请教一下。9 y4 r8 r4 ]: T6 C
这里提到了三个细胞系，MEF是用于诱导iPS的吗？那Plat-E cells 转染慢病毒又是为了什么的？另外SNL细胞作饲养层细胞，是不是也能用MEF作饲养层细胞呢？
3 L9 S8 H7 L6 L7 {; F4 H7 O  T0 w新人求教，问题可能小白的点，烦请各位帮忙解答一下吧！

huangcong1988

回复 midautumn 的帖子9 B9 l6 v3 q0 f8 C- @

$ Q. i0 n+ {1 i9 B' S4 t* R呵呵，其实刚开始都有很多疑问，我也是% p0 A: h$ P7 N/ g" C" i% h
首先，MEF是作为ips诱导的原材料，MEF和TTF都是) K  \& k+ M: f
然后，PLaT-E cell用来收集慢病毒的，因为构建好的慢病毒载体要包装，用慢病毒感染PLaT-E以后收集上清，用来感染MEF，诱导ips产生1 t6 B  l# G6 {9 w; B: [
最后，SNL作为饲养层，有它的特性，你可以网上查查饲养层细胞的性质，很多的，它就是在诱导ips过程中作为一种培养基质的性质

midautumn

回复 huangcong1988 的帖子' B- n& V* S# a) N# Q

# l, m: Y0 r9 T太感谢啦！！

huangcong1988

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. F) q3 ~( F, M, W
7 A& v  C( {1 A3 L, a没事，相互帮助嘛