请教mi-RNA茎环法设计引物

mckf111

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$ H$ b7 g, s8 A% }1 o5S也可以做内参么 人和鼠可以共用同一引物扩吗
# F3 l! ~2 i5 ~# Q) e; P引物序列是什么 还烦请指教

mckf111

回复 runsong 的帖子( b% C, t4 u+ Q- H' E3 p- a3 w: J
5 F0 W; O+ F/ y  A8 v  H& K5 g: h
应该是5'-GCCCGC再加上15bp左右miR的5'端序列 注意把U改成T

王乾

我们也是应用茎环结构的引物来定量microRNA。对于每一个microRNA，我们设计了三条引物：一条反向引物用于反转录，一条正向引物，还有一条通用的反向引物，同时用于pre-PCR扩增步骤和实时定量PCR步骤。特异的反向引物约42-44个核苷酸，其5’端的36个核苷酸序列是固定的，形成一个8核苷酸环和20核苷酸茎的结构，其3’端的6-8个核苷酸就与microRNA互补。正向引物长约25-32个核苷酸，在3’端有11-18个核苷酸与相应的microRNA互补，而剩余14个核苷酸的Tm值高于65摄氏度。通用的反向引物为23nt，其中18个核苷酸对应特异反向引物的茎环结构部分，而5’端的5个核苷酸的Tm值高于65摄氏度。
& {9 _) y7 c7 X+ [; X" C

gunther

"而剩余14个核苷酸的Tm值高于65摄氏度"
, f4 |; S' A% I9 J* c" t6 o/ d是这样吗？
( n3 t# n& K$ [, |7 N所以forward前面的4~6个nt序列总是不一样。
; p% L5 N% K6 @& J( m, [3 [; I% N3 c: i/ f  ~3 M, v) J- o
sunsong最后找到答案了吗？我也想知道！

gunther

9 w. a% N' G% h; g( A4 ?0 i我看文献好像前面那段并不是通用序列，不同mir的forward都不一样，真的仅仅是为了改变TM值吗？, Q6 C3 Y* X7 d8 H2 G; [5 T/ m5 ?

) W- j+ _* H/ X0 ^; ~+ N另外，为什么前面一定要多一段序列呢？
; E, ?* }) J4 L/ l4 s+ R

runsong

回复 gunther 的帖子6 s! c3 Q6 ?* z

7 ?" x6 O$ T( |; R. g我最后没有按照王乾说的做，在设计上游引物时我只是在前面随意加上几个碱基，让整个引物的GC%平衡，退火温度在63——65度之间就行了，没什么问题。
8 [* ]5 ]# X# }6 T8 @其实应该注意的是反转录引物与上游引物之间不要有大于2bp的交叉。否则因为做完反转录后反转录引物的浓度依然很高，用这做PCR的话很容易会将反转录引物作为模板扩出来。我有过这样的教训。

runsong

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$ E) q; e' h- m& D4 T9 ^' e, T5 i" `- o% z
不同mir的forward的确都不一样，而且反转录引物也几乎都不一样。
- _) `& A) R+ A8 c) ]! Wforward的主体其实就是被反转录引物占用6-8bp后mirna剩下的前面那一部分，当然也可以向后延伸1-2bp与反转录引物重叠，在前面我也会加上几个碱基，其理由我感觉就是为了改变TM值，与下游引物匹配。
) d: a) S, Y2 t这套系统的原则是：扩增MIRNA的特异性是通过准特异性反转录与特异性PCR两步实现的，这一点在扩增同一家族的MIRNA时尤为重要。要自己好好体会。
: r6 z, o" O$ f9 l; U2 m: q) g# p2 G) f* ^& C/ O2 x
呵呵，其实都是我自己一个人的观点，仅供参考。

wolf1978

我的建议：进行miRNA引物的设计具有一定的难度，与常规的引物设计差别较大，不是每个都能成功。最好能够选用公司现成的一些产品，包括TaqMan探针、burgle stem-loop引物等等，节省时间，把握性更大！

foodmic

如何设计特异的茎环引物啊？

细胞海洋

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