NSC 传代问题

echo13032619

小女子初入干细胞门，开始养mouse 的神经干细胞，以前用的是传代的细胞系，参考相邻实验室的方法，试剂和他们使用的是一样的，也在他们的孵箱中培养。第一次复苏后细胞长的都还是可以，但是一旦传代，细胞就死亡。用的是invitrogen的0.25%trypsin EDTA 和 0.25%trypsin inhibitor 反应。  后来改用yellow tip机械吹打的方法传代，前两次用吹200，细胞基本维持生长，但是后来一次200次吹打后神经球没有散开，或者还是比较大，于是就吹打了500次，第二天细胞状态很不好，基本都死了。请问是因为吹打次数太多，还是pH出问题了？ 我最后一次机械方法传代的时候，是吹打完了再离心的，就是说当时没有将死细胞除掉。NSC貌似对pH很敏感一样。 我们相邻实验室用胰酶处理，细胞都活的很健康，但是我们胰酶处理细胞就无一例外的死掉了，痛苦啊~ 望各位大侠，指点迷津啊！

huangfei2010

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回复 echo13032619 的帖子1 ^8 `7 l/ A- _
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不要急，一般不用0.25%的胰酶的，浓度太高了，文献上一般不推荐用胰酶的，用的是sigma公司的accutase酶，如果用胰酶的话，用0.05%浓度，消化2-3分钟，上传份文献你参考一下。你们旁边实验的人养干细胞吗？如果养的是肿瘤细胞那就没有可比性，干细胞想养好不太容易，我也摸索了很长时间，但一直不太理想

huangfei2010

bigchock

谢谢

echo13032619

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4 M# R. p& |' Z/ |& _: i/ L5 j( M/ y
* J/ P/ A: d# n您好，谢谢你的回复 这个nature的protocol 我给老板提议过，但是他还是认为要用胰酶尝试出来   打算稀释一半浓度再来试试，谢谢了

huangfei2010

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( D# I" h0 A% b/ |5 r* z关于胰酶消化对神经干细胞的影响，有文献做过对比，上传给你参考，如果你养成功了，也要和我们一起分享经验啊

huangfei2010

echo13032619

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thx for helping  i have got that