关于ES细胞培养液的pH问题

carolshen

在文献中，基本上没有提过这个问题，想请问下这里的朋友们，请问你们在培养ES细胞时，考虑了培养液的pH吗？

hyde

请教各种细胞培养基的颜色
7 R& B: R, @7 c7 ~http://www.stemcell8.cn/thread-25937-1-1.html, H4 ~* @  J+ S/ q& H

痞子的烟头

以前我们实验室用的都是买的培养基DF12，其它的直接加上就可以用，没有测试PH，但是如果是自己的配，必须要测试！

上海过客

新配出来的 培养基是亮黄色 。 加进去过一段时间 后变红色 。 再变成黄色 就不能用了 。9 V1 O$ e$ x; y; Q  K0 t) T
3 \7 |/ |" k' l# n

carolshen

呃，不好意思，谢谢大家的关注！7 g6 p- R% j) v5 p/ K
忘说明一下，我用的是条件培养基，就是制完conditioned medium之后，你们还有调节pH吗？

heather_lu

一般不调

syl82

8 y0 a" W+ u+ s5 h& R8 v* i  e8 C  h- a* J7 E
常见的干细胞培养是胚胎干细胞（ES cells）培养。我们以小鼠的胚胎干细胞培养为例。
4 t( Y  m. H- g. R" p3 B% p- O! o5 S6 u* _- Y
小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）的复苏
' h( J! n! a/ I$ `8 q: ^胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。 ' b  b: \* F2 P7 \

: k8 C  @2 A8 a. E8 D- `, H1 O1 \. v在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。
0 |- |: f" P- ]: W0 x. b把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。
( r# f! G1 z  y( Q2 }吸掉上清（除去冻存液中的DMSO），用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后，加到一个10cm的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
; [" k5 a- B, C1 A& i, X根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于制备滋养细胞层。
4 ~  m6 I5 n& A. w  L6 m& d滋养细胞层（feeder cells layer）的制备 # m  }6 t2 [3 m+ v9 D. q5 j& J
把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml新鲜的MEF培养基，并在避光的条件下加入110μl配好的丝裂霉素C，混匀后放入培养箱培养2h。
9 z1 V. G- R4 F3 ]; _2 W' d把含有丝裂霉素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使用该培养基处理细胞5h）。用PBS(不含二价离子)洗涤细胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约3min，直到细胞悬浮起来。 : D" V' J! |" b4 }' o. u; N
用1ml MEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 % _. i% C! s6 L: P
去掉上清，用1ml MEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1%明胶处理过的细胞培养皿中，用MEF培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37℃培养箱中至少放置10min，之后把明胶吸掉即可） ! X) w, V. y+ W' b! S3 y
一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养基中保持1周左右的时间，或者是把细胞冻存。
- G6 U, ?5 G" S  C9 B/ t小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的复苏 4 U' u, e3 s5 S* o, E  v. R; ], Z
在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。
7 A( O3 S! F& Y3 l把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的ES培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。   E& S$ F* u! B6 ^
吸掉上清（除去冻存液中的DMSO，用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。 1 Z" D( S6 b8 O0 k: g+ _' e; Q
根据情况对细胞进行换液，大约3~4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于后续试验。
8 G! L3 }& C  y小鼠胚胎干细胞的传代 9 M4 c. Y, {9 Q4 Q- M
吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。
! g8 n: H0 S1 U3 m- q1 i1 m用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 6 n1 |# W1 S+ N7 q1 G) G3 d
去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养。ES细胞的分配比可以是1:1到1:10。
6 O8 Q, o) L% S$ ^/ b小鼠胚胎干细胞的冻存
* v! @% _/ J9 W, X. h; W: i! i- c- m吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。 3 z# y0 V8 x7 t, G% r1 M* n
用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 ; c( S( b- m' g& F
去掉上清，用预先配制好的预冷的ES细胞冻存液来重悬细胞（冻存液的量视冻存的细胞量来定，一般一个长满的10cm细胞培养皿可以冻存4~6管），按每管1ml的量分装到冻存管中。梯度降温：4℃20min，-20℃20min，-80℃过夜后迅速转入液氮中。 & ]0 u: V6 T$ M
注意事项
0 R) v; B2 x# K% \8 P1 w! S6 a. m7 U丝裂霉素C在操作时要避光，避免其分解。
: ^& m: t1 F0 Q: `9 d7 YES细胞倾向于聚集生长，因此在复苏时，要选择好培养皿的规格 & k4 z5 O; g, F, E* [7 I# R9 A
ES细胞不能长的太满，应避免使各个克隆之间接触，以免发上分化。
4 _  X( F, R' w' u" C" \为避免水或血清带来的污染，对血清应进行支原体检测，配好的培养基要进行污染测试。