人骨髓间充质干细胞体外培养扩增及向心肌细胞诱导分化的实验研究① - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:38 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：邓方阁  张秀英  曲丽梅  李玉林作者单位：吉林大学基础医学院病理生物学教育部重点实验室，长春 130021   C- V' |* R. N( h6 ?( F& Q, k) G$ Y

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      【摘要】  目的：培养人骨髓间充质干细胞（Human mesenchymal stem cell，hMSCs），探讨hMSCs体外向心肌细胞(Cardiomyocytes, CM)定向诱导分化的实验研究。方法：取人的骨髓血，用Percoll（1.073 g/ml）密度梯度离心及贴壁筛选结合的方法体外培养扩增hMSCs，并进行流式细胞仪分析鉴定其免疫学表型，以未加一抗只加二抗的hMSCs作为平行对照组。选用生长良好、纯度达到95%的P5代hMSCs，用不同诱导浓度的5氮杂胞苷（5Azacytidine）1、5、10和20 μmol/L进行诱导，对诱导后的细胞进行心肌特异性标志Troponin Ⅰ及Desmin的免疫组化鉴定。结果：体外分离纯化培养扩增出hMSCs，其CD44阳性率平均为93.26%±2.48%，与平行对照组(3.42%±1.09%)相比有明显差异(P＜0.01）。经5和10 μmol/L 5Aza诱导分化的hMSCs表达心肌特异性标记TroponinⅠ、Desmin；10 μmol/L 5Aza诱导分化的hMSCs阳性率明显高于5 μmol/L组；在20 μmol/L组中，诱导后超过50%的细胞脱落死亡。结论：hMSCs可体外分离培养扩增，并具有向心肌细胞分化的潜能，5Aza最佳诱导浓度为10 μmol/L。
      【关键词】骨髓人骨髓间充质干细胞（hMSCs） 5氮杂胞苷（5Azacytidine）心肌细胞(CM)3 d/ N& x' d4 b5 t  a" h* U! O- ^
   　　Culture, proliferation and differentiation of human marrow mesenchymal stem cells to cardiomyocytes in vitro" o* J- z( K3 X' k0 G' f

　　DENG FangGe, ZHANG XiuYing, QU LiMei, LI YuLin. - |% j! |/ U; }

　　/ @8 h: Y- H  P! T( b% b9 j) }
7 |& x- _* I+ S4 e. C+ P
　　Key Laboratory of Pathology, Ministry of Education, Jilin University, Changchun 130021,China, @. m: l$ w: I9 L. B+ k

　　［Abstract］Objective:To culture human mesenchymal stem cells(hMSCs) and study their myogenic differentiation in vitro.Methods:Human bone marrow mononuclear cells were selected by gradient centrifugation on percoll at a density of 1.073 g/ml. hMSCs were futher selected and expanded by adhereing peculiarity. The phenotypes of hMSCs were identified by fluorescentactivated cell sorting(FACS). Fifth passage hMSCs, having good growth characteristics and >95% purity were treated for 24 h with 1,5,10 and 20 μmol/L 5azacytidine to induce cellular differentiation. Expression of the cardiacspecific markertroponin Ⅰ and desmin, identified by immunohistochemistry, was used to identify cardiac muscle differentiation.Results:hMSCs expressed a high level of CD44(hMSCs 93.26%±2.48% vs 3.42%±1.09% in a control group,P＜0.01). hMSCs treated with 5 or 10 μmol/L 5azacytidine were demonstrated that troponin Ⅰ and desmin were positive. The number of troponin Ⅰ and desminpositive cells in the culture treated with 10 μmol/L 5azacytidine was visually greater than that in culture treated with 5 μmol/L 5azacytidine. Over 50% of cells became necrotic after culture with 20 μmol/L 5azacytidine.Conclusion:hMSCs can be successfully cultured and expanded in vitro. They have the potential to differentiate into cardiomyocytes. The optimal concentration of 5azacytidine for induction of myocyte differentiation is 10 μmol/L.0 e/ h8 S3 D1 H$ E8 H& \5 l

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　　［Key words］Bone marrow；Human mesenchymal stem cells(hMSCs)；5azacytidine；Cardiomyocytes
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　　骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cell，MSCs）来源于骨髓，具有自我更新及多向分化潜能，在不同的诱导条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、神经细胞等［1，2］。由于MSCs在体内分布广泛，主要存在骨髓中，不受取材、免疫排斥等限制，是一种良好的替代治疗的靶细胞，随着组织细胞工程学和基因工程学的发展，MSCs作为组织工程学中一种重要的种子细胞，成为基因治疗及器官移植等应用研究中的研究热点。由于骨髓中MSCs含量很低（10-5～10-6），要利用MSCs就必须实现体外分离培养扩增。本实验就是对hMSCs体外培养扩增及鉴定，并向心肌细胞诱导分化，为hMSCs修复替代受损心肌等的细胞移植提供实验依据及理论基础，为大量难治性心脏病患者开辟新的治疗途径。
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　　1材料与方法0 u+ d8 y3 [# a  z

　　1.1hMSCs的分离培养及体外扩增［3］在无菌状态下取自愿捐献者的穿刺骨髓血2～5 ml，与等量LDMEM(Hylone，USA)混合，800 r/min离心8分钟，使细胞形成微团。弃上清及脂肪层，再用LDMEM重悬细胞，以等体积比轻轻叠加在Percoll（1.073 g/ml）(Pharmacia，USA)液面上，900 g离心30分钟。用含10%胎牛血清(Hyclone, USA)的LDMEM(内含青霉素及链霉素100 U/ml)重悬细胞，计数细胞，以3106～4106个细胞/cm2接种在24孔板中。接种3～4天后换液，可见贴壁细胞。以后每隔3～4天更换一次培养液。当原代培养细胞接近汇流(>80%)时，弃去培养液，0.25%胰酶（Promega, USA）消化，1∶3传代。  Q+ {* T' G: ^0 g; Z) G1 s: L
0 Q0 k, S* ]6 F$ Q/ ]0 F
　　1.2hMSCs的生长曲线测定［4］取P0、P6、P12 hMSCs分别制备单细胞悬液，以3103个/孔的密度接种于96孔板，每孔体积200 μl 。从第2天起至贴壁细胞铺满整个培养孔底部止，每天随机抽取3个培养孔，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，37℃继续孵育4小时，终止培养，吸出孔内上清，每孔加入100 μl DMSO(Sigma, USA)，振荡96孔板10分钟，使结晶能充分溶解，进行细胞比色。细胞比色选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔OD值，以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。7 E) p9 U3 e% j6 R% V$ ^

　　1.3hMSCs的纯度鉴定胰酶消化收集细胞，1106个/ml细胞与一抗鼠抗人CD34、CD44、CD45和CD105（Neomarker，USA）孵育液常温下孵育30～40分钟。PBS洗涤2次后与FITC标记的二抗4℃避光孵育20～30分钟。PBS冲洗2次后加500 μl PBS重悬细胞，用于流式细胞仪分析。平行对照组为未加一抗的hMSCs。
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　　1.4hMSCs向心肌细胞的诱导分化选生长良好，纯度达到95%的P5代hMSCs以2105个细胞/cm2浓度接种于置有处理过的盖玻片的24孔板中，当细胞融合达到60%～70%时，用5氮杂胞苷（5Azacytidine, Sigma, USA）（设1、5、10、20 μmol/L四个浓度）孵育24小时，再换成不含诱导剂的培养基继续培养。对照组不加5Aza诱导剂。
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　　1.5体外向心肌细胞诱导分化的hMSCs的鉴定/ m$ ?  P! g' {$ N1 j1 w
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　　1.5.1诱导后的hMSCs细胞免疫荧光测定体外向心肌细胞诱导分化的hMSCs细胞爬片用PBS冲洗3次，4%多聚甲醛室温固定30分钟，PBS冲洗3次。用0.1%TritonX100室温下渗透10分钟，PBS冲洗3次，3%过氧化氢阻断30分钟。PBS冲洗后滴加封闭血清30分钟。滴加一抗Troponin Ⅰ（Cell science, USA），37℃孵育2小时，PBS冲洗3次。滴加cy3标记的二抗，常温避光反应30分钟，PBS冲洗3次。激光扫描共聚焦显微镜（LSCM：Olympus FV500，日本）下观察（Fluoview 4.2软件分析）。

　　1.5.2诱导后的hMSCs细胞免疫组化测定诱导后的hMSCs细胞爬片水化10分钟，阻断剂孵育30分钟，PBS冲洗3次，滴加血清封闭30分钟，滴加一抗Des分钟（Neomarker，USA），37℃ 1小时或4℃过夜，PBS冲洗3次，滴加生物素标记二抗37℃30分钟，PBS冲洗3次，滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素三抗，37℃ 30分钟后PBS冲洗3次，DAB显色，Mayer苏木精复染核，酒精系列脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察。

　　2结果3 F% L! H0 ]3 j
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　　2.1hMSCs的形态学观察P0代hMSCs克隆性生长：骨髓单个核细胞接种于24孔板后，3～4天后逐渐出现贴壁细胞，残留的各种类型的血细胞6天后通过完全换液逐渐除去，此时贴壁细胞呈长梭形，为单个或几个细胞的克隆，细胞形态均一（图1A）。培养至10～18天，细胞出现80%～90%的融合，克隆间出现重叠，无接触抑制现象发生。传代后的hMSCs形态上更加趋于一致，均为成纤维细胞样，紧密排列，界限不清，生长旺盛（图1B）。

　　2.2hMSCs的生长曲线原代接种后的2～5天为生长潜伏期，此期为hMSCs的贴壁生长阶段；从第6天开始，贴壁细胞已形成大小不一的多个细胞克隆，此时细胞增殖开始变得活跃起来，第6～9天为MSCs原代培养生长的对数增殖期；第9天后，细胞进入一个平台期，贴壁生长的MSCs开始铺满整个培养孔底面。而hMSCs传代细胞的生长较原代要快, 并具有如下特征：生长滞缓期缩短至2～3天；对数增殖期缩短约为4～6天；对数增殖期结束后至接种后7～8天，MSCs生长逐渐缓慢，进入平台期，见图2。4 ?# L5 Z3 [: E2 \* k

　　2.3hMSCs免疫表型鉴定表达CD44及CD105，其CD44阳性率平均为93.26%±2.48%，与平行对照组(3.42%±1.09%)相比有明显差异(P＜0.01）；不表达CD34、CD45，见图3。
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　　2.4体外向心肌细胞诱导分化的hMSCs的形态学观察hMSCs经5Aza定向诱导后，1 μmol/L组与对照组细胞形态无明显差异，呈典型长梭形；20 μmol/L组细胞形态变小变窄，1周后超过50%的细胞脱落死亡；5和10 μmol/L组细胞形态不规则，部分细胞变长，2周后逐渐由长梭形变为多角形及星形，类似心肌细胞CM，10 μmol/L组较5 μmol/L组更为明显（图1C、D）。5 f% G1 ^( h: x, t

　　图15Aza诱导前后的hMSCs（略）5 V, _2 t; B; F$ d( J% @
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　　Fig.1The hMSCs treated with/without 5Aza

　　Note:A.Morphology of P0 hMSCs(100);B.Morphology of P6 hMSCs(200);C.10 μmol/L 5Aza induced hMSCs for 2 weeks(200);D.5Aza induced hMSCs in 20 μmol/L(200);E.Desmin( )(200);F.Troponin Ⅰ( )(200).

　　图3hMSCs的FACS分析（略）

　　Fig.3FACS analysis of hMSCs' K+ z1 S' i7 _7 O# Y4 _! U# j! A
' e$ \& e  }2 g# {8 g1 a$ H* u
　　图2hMSCs P0、P6、P12生长曲线（略）4 Z  A  Z& O+ p. `5 A+ Z$ X2 ^' _7 d
6 Z. m. o7 M+ o6 w2 ^  V5 Y
　　Fig.2The growing curves of hMSCs in P0, P6, P126 c0 x7 B! U3 }3 t
5 ~4 l3 l0 L$ o$ \- B
　　2.5免疫荧光及免疫组化检测鉴定对照组及1 μmol/L组的hMSCs中Troponin Ⅰ及Desmin阴性，5 μmol/L组hMSCs中Troponin Ⅰ及Desmin弱阳性表达，10 μmol/L组hMSCs中Troponin Ⅰ及Desmin阳性表达（图1E、F）。

　　3讨论, d: g, W+ b/ ^6 i
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　　在成人肌肉组织中，心肌细胞属于永久性细胞，不具有再生能力，其对有丝分裂的反应是细胞肥大而不是再生，坏死的心肌由纤维疤痕组织修复［2，5］。研究发现心肌中也含有干细胞，但数量极少，增殖能力太小，不能满足组织再生的需求［6］。

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　　因此，长久以来，人们一直渴望利用细胞治疗即导入心脏新的细胞、诱导细胞增殖并宿居于心脏、分化成具有功能的心肌细胞，或心肌细胞成形术即在心肌梗塞、疤痕修复或功能障碍的心肌组织中移植心肌细胞，再生有功能的肌肉组织，从而替代坏死、凋亡及功能障碍的心肌细胞及组织，修复受损的心脏，完善心脏的功能［57］。已有多种类型的细胞如自体骨骼肌细胞、平滑肌细胞、成体心肌细胞、胚胎干细胞以及骨髓来源的干细胞用于细胞移植或心肌细胞成形术，但由于多种原因的限制，骨髓来源的干细胞作为心脏修复的理想靶点越来越引人关注［6，8］。
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) z6 T% V# N9 M0 n+ t

　　目前，MSCs向心肌样细胞诱导分化方面的研究起步均较晚，且集中于动物实验水平，而关于人MSCs向心肌细胞诱导分化及实验性治疗尚少。最近，一些研究报道了MSCs向心肌样细胞诱导分化研究，鼠MSCs经5Aza诱导后，MSCs变长，并形成肌管样结构，表达心肌特异性抗体，表明MSCs可分化为心肌样细胞，从而为MSCs用于心肌损伤修复提供了实验基础［9］。; W" I. I! U- H+ q+ N# h, x4 E
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　　hMSCs向心肌细胞分化的调控机制尚不明确，迄今为止，5Aza是诱导MSCs分化为心肌的惟一有效的化学制剂。5Aza诱导hMSCs 向心肌细胞分化可能是hMSCs包含一个甲基化区域以决定成肌转化，一般状态下该区域处于转录失活状态。5Aza是一种甲基转移酶抑制剂，与控制向心肌分化的特异启动子基因上阻遏蛋白结合, 使其去甲基化, 发生构型改变，从而激活启动干细胞向心肌分化［10］。, h: y0 n1 `4 \# o# U5 K- d/ c# C+ N( @
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　　本实验是采用percoll密度梯度离心及贴壁筛选结合的方法，体外培养扩增hMSCs,在限定传代培养后，保持细胞干性即未分化增殖特性。经生长曲线检测发现，传代细胞与原代培养细胞相比,传代细胞的生长潜伏期较短，且增生分裂能力增强，但从P12代以后的细胞开始出现衰老征象，细胞增殖能力有所下降。流式细胞仪分析鉴定hMSCs的免疫表型，hMSCs不表达CD34、CD45，表达CD105及CD44，其中CD44为高表达，说明我们实验所得的细胞非造血细胞，是细胞同源性好、纯度高的hMSCs干细胞群。随后，我们选用纯度达95%的P5代细胞进行体外定向诱导分化实验，并通过免疫荧光及免疫组化技术鉴定经5Aza诱导的hMSCs表达心肌特异性抗体Tropnin Ⅰ及Desmin，表明hMSCs已成功向心肌细胞分化。经实验，我们认为诱导浓度为10 μmol/L的5Aza 24小时孵育最为适宜。
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　　尽管我们在体外成功分离培养扩增出hMSCs，并定向诱导分化出心肌细胞，但体内微环境是干细胞向心肌分化的关键因素，其过程也是复杂的，还需进一步的深入研究。5 [5 H" X* H8 n  d9 ~9 n& b
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